Решу егэ впр 5 класс русский язык: задания, ответы, решения. Обучающая система Дмитрия Гущина.

стантин, С. Скоулз и Б. Эренс. Национальное исследование Великобритании о жестоком обращении и пренебрежении среди пожилых

человек. Уход за пожилыми людьми, 19 (8): 24–26, 2007.

[25] D. McNamara, A. Graesser, Zh. Цай, Я. Куликович. Компоненты Coh-metrix easyability:

Согласование сложности текста с теориями понимания текста. На ежегодном собрании Американской ассоциации образовательных исследований

, Новый Орлеан, Луизиана, 2011 г.

[26] D.Макнамара, А. Грессер, П. Маккарти и Ж. Цай. Автоматическая оценка текста и

дискурса с помощью Coh-Metrix. Cambridge University Press, 2014.

[27] И. Наумов, В. Выхованец. Использование синтаксического анализа текста для оценки сложности и сложности учебных задач. Автоматика и телемеханика, 77 (1): 159–178, 2016.

[28] И. Обобронева. Автоматизированная оценка сложности учебных текстов на основе статистики-

тических параметров. Москва: Институт содержания и методики обучения им. Раэ. М .:

РАН Институт содержания и методов обучения, 2006.

[29] С. Окладникова. Модель комплексной оценки читабельности тестовых материалов на этапе

разработки. Прикаспийский журнал: управление и высокие технологии, 3: 63–71, 2010.

[30] П. Пирсон и Д. Либен. Прогресс понимания прочитанного. Достичь керна, 2013.

[31] Шпаковский Ю.В. и др. Оценка сложности восприятия и оптимизация сложности учебного

текста. Кандидатская диссертация

, 2007.

[32] Сидоров Григорий Александрович. Нелинейное построение n-граммов в компьютерной лингвистике. Мексика:

Sociedad Mexicana de Inteligencia Arti ial, 2013.

[33] Григорий Сидоров, Франсиско Веласкес, Эфстатиос Стамататос, Александр Гельбух и Лил-

Иана Чанона-Эрнандес. N-граммы, основанные на синтаксических зависимостях, как признаки классификации. В

Мексиканская международная конференция по искусственному интеллекту, страницы 1–11. Springer, 2012.

[34] М. Солнышкина, Е. Харькова, Кисельников А. Сравнительный когометричный анализ прочитанных текстов на понимание

: Единый (русский) государственный экзамен по английскому языку и первый кембриджский сертификат

на английском языке.Обучение английскому языку, 7 (12): 65, 2014.

[35] М. Солнышкина, А. Кисельников. Сложность текста: этапы изучения в отечественном

прикладном языке. Вестник Томь-

государственного университета. Филология,

(6 (38)), 2015.

[36] В. Соловьев, В. Иванов. Извлечение событий на основе знаний в русском языке: корпусные

лингвистических ресурсов.Вычислительный интеллект и нейробиология, 2016: 16, 2016.

[37] С. Толдова, О. Ляшевская, А. Бонч-Осмоловская, М. Ионов. Оценка для мор-

физиологически насыщенного языка: Русский НЛП. В материалах Международной конференции по искусственному интеллекту

(ICAI), стр. 300. Руководящий комитет Всемирного конгресса в

Компьютерные науки, компьютерная инженерия и прикладные вычисления (WorldComp), 2015.

[38] Светлана Толдова и Макс Ионов.Обнаружение упоминаний для улучшения разрешения кореферентности в

русских текстах: подход машинного обучения. Computación y Sistemas, 20 (4), 2016.

[39] Э. Воган и Б. Клэнси. Маленький корпус и прагматика. В Yearbook of Corpus Linguistics

и Pragmatics 2013, страницы 53–73. Springer, 2013.

[40] В. Евсеев. Измерение повествовательности художественных текстов. Нарратология вне литературной критики:

медиальность, дисциплинарность, 6: 109, 2005.

11

Генная терапия наследственной слепоты с использованием dCas9-VPR-опосредованной активации транскрипции

Abstract

Каталитически неактивный dCas9, слитый с активаторами транскрипции (dCas9) -VPR) позволяет активировать молчащие гены.У многих генов болезней есть аналоги, которые выполняют аналогичные функции, но экспрессируются в разных типах клеток. Одним из привлекательных вариантов компенсации недостающей функции дефектного гена может быть транскрипционная активация его функционально эквивалентного аналога через dCas9-VPR. Ключевые проблемы этого подхода включают доставку dCas9-VPR, эффективность активации, долгосрочную экспрессию целевого гена и побочные эффекты in vivo. Используя двойные аденоассоциированные вирусные векторы, экспрессирующие расщепленный dCas9-VPR, мы демонстрируем эффективную активацию транскрипции и долгосрочную экспрессию М-опсина, специфичного к фоторецепторам колбочек ( Opn1mw ), на модели пигментного ретинита на мышах с дефицитом родопсина.Через год после лечения этот подход приводит к улучшению функции сетчатки и уменьшению дегенерации сетчатки без видимых побочных эффектов. Наше исследование демонстрирует, что dCas9-VPR-опосредованная активация транскрипции функционально эквивалентных генов имеет большой потенциал для лечения генетических нарушений.

ВВЕДЕНИЕ

Различные наследственные расстройства вызываются мутациями в генах, для которых существуют аналоги со сходной функцией, но отличным паттерном экспрессии. CRISPR-Cas-опосредованная активация транскрипции (трансактивация) таких функционально эквивалентных генов является одной привлекательной терапевтической стратегией для компенсации функции их мутантных аналогов.Различные активаторы транскрипции были слиты с каталитически неактивными белками Cas9 (dCas9) и оценены в отношении их эффективности трансактивации. Среди протестированных кандидатов каталитически неактивный модуль трансактивации dCas9, слитый с активаторами транскрипции (dCas9-VPR), демонстрирует высокую эффективность для различных видов и типов клеток ( 1 ). Однако из-за своего размера (5,8 т.п.н.) dCas9-VPR превосходит упаковочную способность генома рекомбинантных аденоассоциированных вирусных (rAAV) векторов, которые в настоящее время являются золотым стандартом для доставки генов в нативные ткани и для генной терапии.Предыдущее исследование предоставило доказательство принципа восстановления расщепленного dCas9-VPR с использованием двойных rAAV in vitro и in vivo у мышей дикого типа (WT) ( 2 ). Тем не менее, терапевтический потенциал этого инструмента до сих пор не оценивался на моделях болезней. В частности, долгосрочные эффекты, такие как эффективность и экспрессия трансактивированного гена, а также возможные побочные эффекты, остались в значительной степени неизученными.

Унаследованные дистрофии сетчатки (IRD) поражают несколько миллионов человек во всем мире.Пигментный ретинит (RP) является наиболее распространенным подтипом IRD и в первую очередь поражает палочковые фоторецепторы ( 3 ). Напротив, ахроматопсия (ACHM) является одним из наиболее частых IRD, поражающих колбочки ( 4 ). Многие гены, связанные с RP или ACHM, кодируют членов каскада фототрансдукции в палочках или колбочках. Ключевые молекулы фототрансдукции в этих клетках кодируются отдельными, но функционально эквивалентными генами, и мутации во многих из этих генов, таких как зрительные пигменты (опсины) или ионные каналы с циклическими нуклеотидами (CNG), связаны с различными типами ослепления. расстройства.Мутации в гене родопсина ( RHO ) являются основной причиной РП, тогда как мутации в генах колбочкового канала CNG ( CNGA3 и CNGB3 ) являются наиболее частой причиной ACHM. В то время как палочки экспрессируют только родопсин, большинство млекопитающих, включая мышей, экспрессируют в колбочках два типа опсина: коротковолновый S-опсин ( Opn1sw ) и средне-чувствительный M-опсин ( Opn1mw ). Каналы CNG представляют собой гетеротетрамерные комплексы, состоящие из функции канала, определяющей CNG A, и модулирующую субъединицу CNG B.Собственные стержневые каналы CNG содержат CNGA1 и CNGB1 и их конические аналоги CNGA3 и CNGB3 субъединицы соответственно. Предыдущее исследование показало, что палочковые и конические субъединицы CNG A также могут образовывать функциональные единицы с субъединицами CNG B другого типа фоторецепторов, то есть CNGA1 с CNGB3 и CNGA3 с CNGB1 ( 5 ). Учитывая функциональное сходство между природными и химерными каналами CNG, активация соответствующего функционально эквивалентного гена в палочках или колбочках представляется привлекательным вариантом лечения.Недавняя работа с моделями мышей показала, что родопсин и опсины колбочек также функционально эквивалентны ( 6 — 9 ). Это предполагает, что активация генов, кодирующих опсины колбочек в палочках, может компенсировать дефектный родопсин в соответствующих моделях животных.

Здесь, используя dCas9-VPR, мы смогли эффективно трансактивировать гомолог Rho Opn1mw и палочко-специфический гомолог Cnga3 Cnga1 in vitro. Используя двойную векторную систему rAAV для расщепленной dCas9-VPR-опосредованной активации Opn1mw на модели RP с дефицитом родопсина у мышей, мы также демонстрируем, что это лечение приводит к безопасной и эффективной долгосрочной экспрессии, усилению функции сетчатки и задержке дегенерации сетчатки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Трансактивация Cnga1 и Opn1mw в временно трансфицированных клетках 661W и MEF

Для проверки возможности и эффективности эктопической активации неэкспрессированных или плохо экспрессируемых генов мы трансфицировали различные линии клеток мыши с помощью dCas9-VPR в комбинации с одним проводником. РНК (sgRNAs) связываются с промоторной областью либо мыши Cnga1 , либо Opn1mw (фиг. 1A). Поскольку эффективность трансактивации может быть увеличена с увеличением количества sgRNA ( 1 ), мы использовали комбинацию из трех sgRNA для каждого из генов.Трансактивация Cnga1 была адресована в клетках 661W, иммортализованных производных мышиных колбочек, лишенных экспрессии Cnga1 ( 10 ). Поскольку клетки 661W эндогенно экспрессируют Opn1mw , мы использовали клетки эмбриональных фибробластов мыши (MEF) для трансактивации этого гена.

( A ) Положение связывания трех sgRNA, используемых для нацеливания dCas9-VPR на промотор гена Cnga1 или Opn1mw , соответственно.Относительное расстояние каждой sgRNA до сайта начала транскрипции (TSS) целевого гена дано в парах оснований. ( B ) Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (qRT-PCR) клеток 661W, котрансфицированных dCas9-VPR и sgRNA Cnga1 или lacZ . Экспрессия Cnga1 была нормализована к контролю lacZ . ( C ) qRT-PCR из клеток MEF, котрансфицированных dCas9-VPR и sgRNA Opn1mw или lacZ .Экспрессия Opn1mw была нормализована к контролю lacZ . Двусторонний непарный тест t с поправкой Велча был использован для статистического анализа в (B) и (C). ( D — G ) qRT-PCR из клеток 661W-pb (D и E) или MEF-pb (F и G), культивированных при различных концентрациях доксициклина (DOX), как указано. Экспрессия Cnga1 была нормализована до DOX (500 нг / мл), а экспрессия Opn1mw и dCas9-VPR была нормализована до DOX (0 нг / мл).

В клетках 661W, временно котрансфицированных кассетой dCas9-VPR и Cnga1 -специфическими sgRNA, мы наблюдали эффективную трансактивацию Cnga1 на уровне транскрипта, которая отсутствовала в контрольных клетках, экспрессирующих lacZ sgRNA (Fig. и рис. S1A). Тем не менее, сигнал белка Cnga1 не обнаруживался в клетках, меченных специфическим антителом в этих условиях.

При рассмотрении трансактивации Opn1mw в клетках MEF мы обнаружили транскрипт Opn1mw как в наивных, так и в lacZ sgRNA-экспрессирующих клетках, что указывает на эндогенную экспрессию Opn1mw в этой клеточной линии (рис.S1B). Известно, что эффективность dCas9-опосредованной трансактивации отрицательно коррелирует с базальным уровнем экспрессии данного гена ( 1 ). Тем не менее, несмотря на базальную экспрессию Opn1mw , устойчивая трансактивация Opn1mw была обнаружена в клетках MEF, коэкспрессирующих dCas9-VPR и Opn1mw -специфические sgRNA (фиг. 1C и фиг. S1B). Комбинация другого набора из трех sgRNA Opn1mw не смогла дополнительно повысить эффективность трансактивации (рис.S1, C и D). Эти результаты показывают, что в временно трансфицированных клетках как Cnga1 , так и Opn1mw можно эффективно трансактивировать с использованием dCas9-VPR.

Трансактивация в клеточных линиях, стабильно экспрессирующих индуцибельные кассеты sgRNA dCas9-VPR

Затем мы проанализировали, может ли белок Cnga1 быть обнаружен в независимой от трансфекции системе. Для этого мы создали линии клеток 661W и MEF со стабильной интеграцией кассет экспрессии для доксициклина (DOX) -индуцибельного dCas9-VPR в сочетании с Cnga1 , Opn1mw или lacZ -специфическими sgRNA (661W – piggyBac [661W – piggyBac ) и MEF-pb соответственно].При анализе транскрипта Cnga1 в клетках 661W мы обнаружили трансактивацию этого гена, зависящую от концентрации DOX. Однако сильная трансактивация Cnga1 также присутствовала в отсутствие DOX, что указывает на неплотную активность DOX-зависимого промотора, управляющего экспрессией dCas9-VPR. Более того, увеличение экспрессии Cnga1 было получено только при самой низкой концентрации DOX (5 нг / мл), тогда как уровни Cnga1 снижались с дальнейшим увеличением концентрации лекарственного средства (рис.1D). Таким образом, при превышении оптимальной концентрации DOX наблюдалась обратная корреляция между уровнями транскрипта dCas9-VPR и эффективностью трансактивации Cnga1 (рис. 1E). Очень похожие результаты были получены в клетках MEF, стабильно экспрессирующих кассету dCas9-VPR и Opn1mw sgRNA, что указывает на то, что этот эффект не зависит от гена (фиг. 1, F и G). В отличие от Cnga1 , не было очевидной трансактивации Opn1mw в MEF, стабильно экспрессирующих dCas9-VPR, и Opn1mw -специфичных sgRNAs в отсутствие DOX, что, скорее всего, связано с эндогенной базальной экспрессией этого гена в данном гене. клеточная линия.

Таким образом, эти результаты предполагают, что существует оптимальное окно для трансактивации, в котором достаточные уровни белка dCas9-VPR поддерживают максимальные уровни экспрессии гена. При превышении оптимального уровня dCas9-VPR происходит постепенное снижение эффективности трансактивации.

Анализ экспрессии и функции белка в трансактивированных клетках

Затем мы оценили экспрессию белков Cnga1 и M-опсина в соответствующих стабильных клеточных линиях, обработанных оптимальной концентрацией DOX.В этих условиях не было обнаружено явного увеличения экспрессии белка М-опсина по сравнению с контрольными клетками (фиг. S1E). Для Cnga1, однако, мы смогли обнаружить устойчивый сигнал, который отсутствовал в линии клеток 661W, экспрессирующей lacZ sgRNA (Fig. 2A). Чтобы выяснить, могут ли функциональные каналы быть сформированы из белков, экспрессируемых из трансактивированного локуса Cnga1 , мы провели электрофизиологические записи в клетках 661W, культивируемых при оптимальной концентрации DOX.В отличие от контрольной линии клеток lacZ , у которой отсутствуют какие-либо ответы, подобные каналам CNG, можно было измерить несколько характеристик, специфичных для канала Cnga1, включая чувствительность к гуанозин-3 ‘, 5’-циклическому монофосфату (цГМФ), блокировку кальция и магния и внешнюю ректификацию. при трансактивации этого гена (рис. 2, B — D). Это указывает на то, что успешная трансактивация с помощью dCas9-VPR может приводить к полностью функциональным каналам Cnga1.

( A ) Иммуноокрашивание клеток 661W-pb, стабильно экспрессирующих dCas9-VPR и lacZ — (sglacZ, верхний ряд) или Cnga1 -специфических sgRNA (sgCnga1, нижний ряд) в присутствии DOX (5 нг / ml) с использованием антител, специфичных к Cas9 и Cnga1. Масштабная линейка 30 мкм. ( B ) Репрезентативные следы тока, записанные с внутренней стороны участков индуцированных DOX клеток 661W-pb в присутствии 300 мкМ цГМФ (слева, I _CNG ) или цГМФ и Ca ²⁺ / Mg ²⁺ (справа я _блок ).( C ) Количественная оценка индуцированных цГМФ токов в отсутствие (I _CNG ) или в присутствии Ca ²⁺ / Mg ²⁺ (I _block ) (непарный тест t с поправкой Велча , двусторонний). ( D ) График вольт-амперной характеристики индуцированных cGMP токов от участков мембраны sgCnga1 или sglacZ.

Трансактивация Cnga1 и Opn1mw в клетках, экспрессирующих расщепленный интеин dCas9-VPR

Из-за ограниченной способности rAAV к упаковке генома вся кассета dCas9-VPR не может быть упакована в один вектор rAAV для доставки in vivo.Чтобы обойти это ограничение, в двух недавних исследованиях использовалась технология расщепления интеина для восстановления (d) Cas9-VPR или его производных на уровне белка при совместной доставке двух отдельных двойных rAAV, каждый из которых экспрессирует половину расщепленного Sp . Кассета Cas9 ( 2 , 11 ). Известно, что эффективность восстановления, опосредованного расщепленным интеином, зависит от положения интеграции интеина в соответствующем белке ( 12 ). Вышеупомянутые исследования касались трансактивации расщепления (d) Cas9-VP (R) либо после аминокислотного положения E573 ( 11 ), либо после V713 (рис.S1F) ( 2 ). Тем не менее, насколько нам известно, на данный момент отсутствуют количественные или сравнительные данные об эффективности восстановления, полученные с помощью этих двух подходов. Поскольку такие данные были бы очень полезны для достижения оптимальных результатов in vivo, мы сначала решили сравнить эффективность восстановления для обоих подходов бок о бок на уровне белка. С этой целью мы временно котрансфицировали клетки 293 эмбриональной почки человека (HEK) плазмидами, кодирующими половинки Sp Cas9, пересекающиеся после положения E573 или V713 (рис.S1G) и количественно оценили эффективность восстановления. Мы обнаружили, что эффективность восстановления расщепления варианта Sp Cas9 после V713 (56,9 ± 2,1%) была значительно выше, чем у его аналога, расщепленного после положения E573 (33,3 ± 2,1%) (рис. S1H).

Затем мы проверили, приводит ли коэкспрессия расщепленных фрагментов dCas9-V713-VPR также к эффективной трансактивации Cnga1 и Opn1mw в соответствующих клетках. Хотя эффективность трансактивации для обоих генов-мишеней, происходящих из расщепленного dCas9-VPR, была ниже, чем для полноразмерного dCas9-VPR, она все же оказалась устойчивой и достаточно высокой по сравнению с соответствующими контролями (рис.S1, I и J). Вместе мы показываем, что расщепление dCas9-VPR после положения V713 может трансактивировать как Cnga1, так и Opn1mw в экспериментах на культуре клеток и, следовательно, использовали для последующих экспериментов in vivo.

Split dCas9-VPR эффективно трансактивирует опсины колбочек у мышей WT

Далее мы сосредоточились на активации Opn1mw в палочковидных фоторецепторах, чтобы предоставить in vivo доказательство концепции трансактивации функционально эквивалентных генов с использованием двойных AAV расщепленных dCas9-VPR.Для этой цели мы совместно вводили совпадающие по титру двойные rAAV, экспрессирующие расщепленный dCas9-VPR под контролем промотора родопсина человека и Opn1mw- специфичных sgRNA (фиг. 3A). Учитывая высокий процент палочек, ожидается, что активация Opn1mw в этом типе клеток наложит эндогенную мРНК Opn1mw и сигнал белка, исходящий от более редких колбочек, которые составляют только 3% от общей популяции фоторецепторов у мышей. . Для начальных экспериментов мы использовали животных WT (+ / +), которым субретинально инъецировали на 28-й постнатальный день (P28) двойные rAAV расщепления dCas9-VPR.Через четыре недели после инъекции наблюдалось устойчивое увеличение уровней транскрипта Opn1mw в глазах, которым одновременно вводили двойные rAAV, по сравнению с глазами, которым вводили физиологический раствор (фиг. 3B). Эта повышающая регуляция транскрипта Opn1mw была также подтверждена секвенированием РНК (RNA-seq) (фиг. S2A). Более того, мы смогли обнаружить сильный сигнал M-opsin с помощью M-opsin-специфических антител в наружных сегментах фоторецепторов палочек (Fig. 3C). Эта специфическая для палочковых фоторецепторов экспрессия М-опсина отсутствовала в необработанных сетчатках, которые показывают сигнал М-опсина только в фоторецепторах колбочек (рис.3D). Ободренные этим открытием, мы рассмотрели, может ли S-опсин ( Opn1sw ), еще один гомолог Rho и потенциальный кандидат для трансактивации у мышей с дефицитом родопсина, также трансактивироваться в палочках с использованием того же подхода. Подобно Opn1mw , в сетчатках, экспрессирующих расщепленные двойные rAAV dCas9-VPR и Opn1sw -специфические sgRNAs, мы также могли обнаруживать белок S-Opsin во внешних сегментах палочек (рис. 3, E и F). Примечательно, что наблюдалась очевидная вариабельность экспрессии белков трансактивированных M-опсина и S-опсина от эксперимента к эксперименту (рис.S2, B — E).

( A ) Схема расщепленных dCas9-VPR и sgRNA, кодирующих двойные векторы rAAV, используемые для трансактивации Opn1mw (от B к D) и Opn1sw (E и F) у мышей C57Bl / 6J WT (+ / +) . ( B ) qRT-PCR для экспрессии Opn1mw после трансактивации через 4 недели после инъекции ( Opn1mw -ta). Выражение было нормализовано для контрольных глаз, которым вводили раствор NaCl (физиологический раствор, n = 6 глаз, парный тест t , двусторонний).( C — F ) Иммуномечение двух мышей + / +, которым инъецировали Opn1mw — (C) или Opn1sw , трансактивирующие двойные AAV (E). Контралатеральные глаза (D и F) обеих мышей служили контролем (необработанные) (D и F). Агглютинин арахиса (PNA; пурпурный) использовали в качестве маркера шишек. Масштабные линейки 30 мкм.

Трансактивация Opn1mw задерживает дегенерацию сетчатки и улучшает функцию сетчатки у мышей Rho

Затем мы также проверили, достаточно ли трансактивации Opn1mw для улучшения фенотипа RP у гетерозиготного родопсина с дефицитом 90−607 +/ ) Модель мыши RP ( 13 ).В отличие от мышей Rho ^{— / —} , у которых с рождения полностью отсутствуют внешние сегменты палочек, гетерозиготные мыши способны развивать укороченные, но функциональные внешние сегменты ( 13 , 14 ), что, как ожидается, будет важным предварительным условием для лечение, требующее инъекций в более позднее время. Мышам Rho ^+/- субретинально инъецировали на Р14 двойные rAAV-векторы с согласованным титром, экспрессирующие расщепленные sgRNA dCas9-VPR и Opn1mw . В контралатеральный контрольный глаз вводили раствор NaCl (физиологический раствор).Поскольку у мышей Rho ^+/- наблюдается медленное течение дегенерации сетчатки ( 13 ), мы оценили эффекты нашего лечения через 1 год после инъекции. Дегенерация сетчатки сопровождается уменьшением количества фоторецепторов, состояние, которое можно лечить неинвазивно с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ), измеряющей толщину внешнего ядерного слоя (ONL). Записи ОКТ из глаз, экспрессирующих расщепленные sgRNA dCas9-VPR и Opn1mw , выявили увеличение толщины ONL по сравнению с глазом, которому инъецировали контрлатеральный физиологический раствор, что позволяет предположить, что наше лечение способно замедлить дегенерацию (рис.4A и рис. S2F). Сходные результаты были получены при сравнении толщины ONL между обработанными и инъецированными физиологическим раствором глазами с использованием независимого метода, основанного на гистологическом анализе криосрезов сетчатки (рис. S2G).

( A ) ОКТ-измерения мышей Rho ^+/- , которым вводили раствор NaCl (+/- физиологический раствор, n = 10 глаз) или двойные rAAV, экспрессирующие расщепленные dCas9-VPR и Opn1mw -специфические sgRNA ( +/− обработано, n = 10 глаз).Соответствующие по возрасту мыши C57Bl / 6J WT (+ / +, n = 14 глаз) использовали в качестве контроля. Статистический анализ выполняли с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки. ( B и C ) Усредненные фотопические и скотопические следы тех же мышей Rho ^+/- и WT при 10 кд.с / м ² . ( D и E ) Количественная оценка адаптированных к свету фотопических амплитуд a- и b-волн тех же групп. ( F и G ) Адаптированные к темноте скотопические амплитуды a- и b-волн одних и тех же групп в зависимости от интенсивности света.Все значения P для каждого сравнения (+/- обработанный по сравнению с +/- физиологическим раствором, +/- обработанный по сравнению с + / + и +/- физиологический раствор по сравнению с + / +) показаны на рис. S5E.

Чтобы оценить положительное влияние нашего подхода на палочко-опосредованную (скотопическую) и конус-опосредованную (фотопическую) функцию сетчатки, электроретинографические (ЭРГ) измерения были выполнены у адаптированных к темноте и адаптированных к свету мышей Rho ^+/- соответственно ( Рис. 4, B – G, и рис. S3 и S4). Соответствующий статистический анализ был проведен двумя разными способами: (i) Мы выполнили тест множественного сравнения, чтобы сравнить амплитуды ERG при разной интенсивности света всех трех групп (WT и мыши Rho ^+/- , получавшие лечение или инъецированные физиологическим раствором ; Рисунок.4), и (ii) мы провели парное сравнение амплитуд ЭРГ только для обработанных глаз и глаз, которым вводили физиологический раствор (рис. S5).

У адаптированных к свету животных было достигнуто увеличение амплитуды a-волны в глазах с двойной инъекцией rAAV при максимальной интенсивности световой вспышки по сравнению с глазами, которым вводили физиологический раствор, и необработанными животными WT (рис. 4D). Более того, при попарном сравнении обработанных глаз только с соответствующими аналогами, которым вводили физиологический раствор, можно было наблюдать увеличение фотопической амплитуды a-волны для двух самых высоких интенсивностей вспышки (рис.S5A). Это указывает на то, что в этих условиях палочки, экспрессирующие M-opsin, могут отвечать на интенсивность активации колбочек. Небольшое тенденционное улучшение было также обнаружено в фотопических амплитудах b-волн в обработанных глазах при максимальной интенсивности вспышки (фиг. 4E и фиг. S5B). Обращаясь к палочко-опосредованной функции у адаптированных к темноте животных, мы могли измерить небольшую тенденцию улучшения скотопической a-волны в сторону WT-подобных ответов (рис. 4F и рис. S5C). Для сравнения, при сравнении обработанных глаз с их аналогами, которым вводили физиологический раствор, наблюдалась устойчивая тенденция к улучшению скотопической b-волны (рис.4G и рис. S5D). Эта тенденция была более выраженной с увеличением интенсивности света, что дополнительно подтверждает предположение, что обработанные палочки, экспрессирующие M-опсин, способны реагировать на стимулы, активирующие колбочки. Отдельные значения P для всех измерений ERG, показанных на рис. 4, суммированы на рис. S5E. В конечном итоге эти данные предполагают, что трансактивация Opn1mw может улучшить дегенерацию сетчатки и приводит к частичному улучшению функции сетчатки на мышиной модели Rho ^+/- RP.

Трансактивация Opn1mw снижает апоптоз без индуцирования глиоза или инвазии иммунных клеток у мышей Rho

В другой серии экспериментов мы также проанализировали экспрессию белка М-опсина и маркеры потенциального глиоза, апоптоза или иммунный ответ в сетчатке мышей, используемых для измерений ОКТ и ЭРГ. Аналогично результатам, полученным на мышах WT (см. Рис. 3С и рис. S2), мы обнаружили значительную экспрессию трансактивированного М-опсина в наружных сегментах палочек инъецированных животных, которая, однако, варьировала между животными (рис.5, А и В, и фиг. S6 и S7). Кроме того, чтобы оценить трансляционный потенциал этого подхода, мы изучили, вызывает ли наше лечение стойкий глиоз или иммунные ответы, которые будут сопровождаться пролиферацией глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) — положительной глии Мюллера или ионизированной молекулы адаптера связывания кальция 1 (Iba -1) — положительные микроглиальные или мононуклеарные клетки сетчатки. Иммунное мечение сетчатки этими маркерами не выявило явного увеличения количества глиальных, микроглиальных или мононуклеарных клеток между различными группами, в отличие от сетчатки мышей rd1 (дегенерация сетчатки 1), демонстрирующих быструю дегенерацию сетчатки с пиком на P13 (рис.5, от C до H и рис. S8) ( 15 ). Чтобы выяснить, вызвана ли дегенерация фоторецепторов апоптозом на модели мышей Rho ^+/- , мы провели анализ опосредованного дезоксинуклеотидилтрансферазой ник-концевого мечения дезоксиуридинтрифосфата (TUNEL) на срезах сетчатки обработанных мышей Rho ^+/- . (Рис.6, А и Б). В этом анализе мы смогли обнаружить небольшое, но значительное количество TUNEL-положительных клеток, что указывает на то, что апоптоз является основным механизмом потери фоторецепторов в этой модели мышей.Более того, сравнивая количество TUNEL-положительных клеток на область в трансдуцированной и нетрансдуцированной части обработанной сетчатки, мы показываем, что трансактивация Opn1mw снижает апоптоз (фиг. 6C). Эти данные дополнительно подчеркивают благотворное влияние нашего лечения на выживаемость фоторецепторов.

( A и B ) Репрезентативные иммуноокрашивания сетчатки от Rho ^+/- мыши № 1, инъецированной либо расщепленными dCas9-VPR и Opn1mw- -специфическими sgRNA (A) (обработанными) или NaCl (B) ( физиологический раствор, контралатеральный глаз).Антитело к периферину-2 (PRPh3, голубой) использовали в качестве маркера внешнего сегмента палочек и колбочек, а PNA (пурпурный) в качестве маркера колбочек. ( C — F ) Иммуномечение тех же сетчаток с помощью Iba1 или GFAP (голубой) для визуализации микроглиальных клеток или реактивного глиоза в обработанном (C и E) и контрлатеральном глазу, которому вводили физиологический раствор (D и F). ( G и H ) Иммуномечение сетчатки от мышей с дефицитом Pde6b (rd1) на P13 с помощью Iba1 (G, голубой) или GFAP (H, голубой) служило в качестве положительного контроля.Масштабные линейки 30 мкм.

( A ) Репрезентативные срезы иммуномеченой сетчатки от Rho ^+/- мыши № 1, инъецированные расщепленными dCas9-VPR и Opn1mw- -специфическими sgRNAs, показывающими трансдуцированную (слева) или нетрансдуцированную (справа) область одного и того же сетчатка через 1 год после инъекции. ( B ) Иммуномечение сетчатки мыши rd1 на P13 служило положительным контролем.Окрашивание TUNEL (пурпурный, вверху) использовали для визуализации апоптоза, PRPh3 (голубой) использовали в качестве маркера внешнего сегмента палочки и колбочки (внизу). Масштабная линейка 30 мкм. ( C ) Количественная оценка клеток TUNEL ⁺ в трансдуцированных и нетрансдуцированных областях сетчатки от восьми мышей Rho ^+/- , которым инъецировали расщепленные sgRNA dCas9-VPR и Opn1mw- . Для статистического анализа использовали парный тест t (двусторонний).

Характеристика необработанных мышей Rho

Интерпретация полученных результатов в значительной степени основана на сравнении обработанных мышей Rho ^+/- с контрлатеральным глазом, которым вводили физиологический раствор.Чтобы выяснить, может ли инъекция физиологического раствора вызывать некоторые эффекты сама по себе, мы охарактеризовали дегенерацию и функцию сетчатки, реактивный глиоз, рекрутирование иммунореактивных клеток и апоптоз у необработанного Rho ^{+ / соответствующего возраста (1 год) —} мышей и сравнили эти параметры бок о бок с параметрами, полученными для контрольных глаз, которым вводили физиологический раствор. За исключением очень небольшого уменьшения амплитуды фотопической b-волны при интенсивности одной световой вспышки (0,1 кд.с / м ² ) после инъекции физиологического раствора, не было заметных различий ни по одному из этих параметров между двумя группами (рис. .S9). Таким образом, введение физиологического раствора, скорее всего, не повлияет на интерпретацию наших результатов и успех лечения.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы предоставляем первое доказательство того, что эктопическая активация транскрипции функционально эквивалентных генов с использованием расщепленного dCas9-VPR может улучшить фенотип заболевания, дополнительно расширяя спектр возможностей лечения генетических нарушений. Учитывая, что многие IRD-связанные гены, экспрессируемые в палочках или колбочках, кодируются функционально эквивалентными генами, подход трансактивации обеспечивает привлекательный вариант терапии этих заболеваний по нескольким причинам: (i) Трансактивация функционально эквивалентных генов может использоваться для лечения большие и часто встречающиеся гены IRD, такие как ABCA4 или MYO7A, , которые не могут быть эффективно восстановлены с использованием классических двойных векторов AAV. ABCA4 и MYO7A принадлежат к большому семейству белков со многими функционально эквивалентными партнерами, экспрессируемыми в разных типах клеток. Некоторые из этих партнеров, например, ABCA1 или MYO7B , демонстрируют очень высокую структурную консервативность по отношению к ABCA4 и MYO7A , соответственно, с идентичностью по крайней мере 50% аминокислот и 65% сходства аминокислот и, следовательно, представляют собой высокую привлекательные кандидаты для трансактивации. (ii) Подход трансактивации также можно использовать для терапии генов с аутосомно-доминантным наследованием, для которых доставка гена должна сочетаться с одновременным нокаутом больного аллеля.Недавние исследования продемонстрировали, что sgRNA с укороченной длиной спейсера (<16 оснований) репрессируют каталитическую активность Cas9-VPR ( 16 , 17 ). Стратегия комбинирования каталитически активного Cas9-VPR с sgRNA укороченной длины спейсера для трансактивации и со стандартными sgRNA (обычно длиной спейсера 20 оснований) для одновременного подавления патологического гена может, например, использоваться для лечения наиболее распространенного родопсина. Мутация P23H с усилением функции, но также должна быть применима к другим мутациям в RHO или к другим генам с аутосомно-доминантным наследованием.(iii) Благодаря возможности мультиплексирования подходов CRISPR-Cas, трансактивация потенциально может также использоваться для лечения более сложных заболеваний (сетчатки), например, вызванных мутациями в двух или нескольких генах ( 18 — 20 ). (iv) Подход (d) Cas9-VPR-опосредованной трансактивации не зависит от мутаций и, таким образом, позволяет лечить большое количество пациентов.

Используя альтернативные стратегии активации, два недавних исследования продемонстрировали, что основанная на CRISPR-Cas9 трансактивация структурно и функционально родственных генов может улучшать фенотипы двух разных мышиных моделей мышечной дистрофии ( 21 , 22 ).Необходима дополнительная работа, чтобы сравнить эффективность трансактивации, долгосрочные эффекты и безопасность между этими подходами и dCas9-VPR бок о бок, чтобы определить лучшую стратегию лечения отдельных заболеваний. Также остается исследовать, могут ли другие положения расщепления в dCas9-VPR ( 23 ) или другие технологии восстановления больших кодирующих последовательностей дополнительно улучшать эффективность трансактивации и / или терапевтический результат подходов, основанных на dCas9-VPR.В отличие от своего каталитически активного аналога, dCas9 и его гибридные варианты не вызывают одно- или двухцепочечных разрывов на геномном уровне. Исследования, направленные на нецелевые уровни dCas9-VPR на уровне транскриптов, показали, что такие нецелевые показатели очень низкие или необнаруживаемые ( 1 , 2 ), что еще больше подчеркивает терапевтический потенциал этого подхода. Мы демонстрируем здесь, что технология расщепления dCas9-VPR может вызывать долгосрочную экспрессию и морфологические, а также функциональные фенотипические изменения в животной модели без видимых побочных эффектов, таких как глиоз или инвазия иммунных клеток.Таким образом, эти многообещающие результаты могут помочь продвинуть этот подход к первым клиническим испытаниям. Примечательно, что, как и в предыдущих исследованиях генной терапии сетчатки у мышей, мы не смогли полностью восстановить WT-подобную функцию или морфологию сетчатки. Одна из возможных причин заключается в том, что однократная субретинальная инъекция обычных капсидов rAAV обычно покрывает только до одной трети сетчатки, и, следовательно, можно ожидать амплитуды до 30% ответа дикого типа. Мы предполагаем, что функциональные или структурные улучшения могут быть дополнительно увеличены за счет разработки более мощных векторов rAAV, которые демонстрируют панретинальную экспрессию при субретинальной инъекции (например,g., из-за латерального распространения) или которые позволяют использовать другие более удобные пути введения (например, интравитреальная инъекция). Кроме того, мы используем подход с двумя векторами rAAV, который требует, чтобы оба вектора были экспрессированы и воссозданы в одной и той же клетке. Соответственно, можно было бы извлечь выгоду из более эффективных стратегий или методов двойного вектора rAAV для увеличения эффективности восстановления расщепленного dCas9-VPR.

Наконец, мы также предоставляем первые доказательства in vitro того, что эффективность трансактивации обратно коррелирует с экспрессией dCas9-VPR в системе, не зависящей от трансфекции.Остается выяснить, имеет ли эта неожиданная дозовая зависимость dCas9-VPR также in vivo и отражает ли она врожденное свойство других каталитически активных и неактивных Cas9 или других вариантов Cas. Точное понимание этой корреляции может помочь в дальнейшем улучшении и точной настройке эффективности этих ферментов и, таким образом, может также повысить терапевтический результат подходов на основе CRISPR-Cas.

МЕТОДЫ

Животные

Все процедуры с животными проводились с разрешения местных властей (районное правительство Верхней Баварии) и в соответствии с немецкими законами о защите животных (Tierschutzgesetz).Животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (40 мг / кг веса тела) и ксилазина (20 мг / кг веса тела). Эвтаназию проводили путем шейного вывиха. Для всех экспериментов использовали мышей C57Bl / 6J или Rho ^+/- ( 13 ), подвергнутых обратному скрещиванию с фоном C57Bl / 6J в течение по меньшей мере восьми поколений.

Дизайн sgRNA

Для идентификации промоторных областей использовалась база данных эукариотических промоторов (https://epd.epfl.ch//index.php) ( 24 ).Последовательности sgRNA в области-мишени генома были выбраны с использованием веб-сайта CRISPOR с настройками 20bp-NGG PAM для Sp Cas9 ( 25 ) и удалением sgRNA с оценкой специфичности ( 26 ) ниже 50. Использованы все последовательности sgRNA. в этом исследовании показаны в таблице S1.

Конструирование и клонирование плазмид экспрессии

Плазмиды Cas9m4-VP64, SP-dCas9-VPR, pSMVP-Cas9N, pSMVP-Cas9C и pAAV-CMV-Cas9C-VPR были получены от Addgene (# 47319, # 63798, # 80934, 80939 и 80933 соответственно).sgRNA, экспрессируемые через промотор U6, добавляли с использованием стандартных методов клонирования. Cas9N и Cas9C были превращены в каталитически неактивные путем введения точечных мутаций D10A и H840A с помощью стандартного протокола сайт-направленного мутагенеза с использованием набора KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR (Kapa Biosystems). Для создания стабильных клеточных линий dCas9-VPR субклонировали в вектор экспрессии pb, содержащий систему Tet-On для DOX-индуцируемой экспрессии dCas9-VPR. Для экспрессии в фоторецепторах мышей расщепленный dCas9-VPR, управляемый промотором родопсина человека, и соответствующие sgRNA, каждая из которых управляется промотором U6 человека, были субклонированы в pAAV2.1 вектор ( 27 ). Перед использованием все трансгены секвенировали (Eurofins Genomics).

Культура клеток и трансфекция

Клеточная линия 661W мыши, полученная из опухолей сетчатки, была предоставлена ​​M. Al-Ubaidi, Университет Хьюстона ( 28 ). Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), среде GlutaMAX (ThermoFisher Scientific) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Biochrom) и 1% анти-анти-анти (ThermoFisher Scientific) при 37 ° C и 10% CO _{. 2} .Бессмертные MEF были созданы, как описано ранее ( 29 , 30 ). Клетки MEF культивировали в среде DMEM GlutaMAX с добавлением 10% FBS (Biochrom) и 1% пенициллина / стрептомицина (Biochrom) при 37 ° C и 5% CO ₂ . Временные трансфекции клеток 661W и MEF выполняли с использованием реагента для трансфекции Xfect (Takara Bio) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки HEK293 трансфицировали стандартным методом фосфата кальция.

Создание стабильных клеточных линий с использованием технологии pb

Стабильные клеточные линии были получены с использованием системы транспозонов pb.Вкратце, клетки 661W или MEF котрансфицировали соответствующими dCas9-VPR и sgRNA, содержащими вектор pb и вектор экспрессии транспозазы pb, с использованием реагента для трансфекции Xfect (Takara Bio) в соответствии с инструкциями производителя. Через 48-72 часа после трансфекции клетки отбирали для успешной интеграции путем добавления дигидрохлорида пуромицина (Gibco, Thermo Fisher Scientific) в течение приблизительно 1 недели при концентрации 4,5 и 1 мкг / мл для клеток 661W и MEF соответственно.Чтобы вызвать экспрессию dCas9-VPR, гиклат DOX (Sigma-Aldrich) добавляли непосредственно в среду.

Выделение РНК и (количественная) полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

Через сорок восемь часов после трансфекции клетки собирали и лизировали с использованием смесительной мельницы MM400 (Retsch). РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя, а концентрацию и чистоту РНК определяли с помощью NanoDrop2000 (ThermoFisher Scientific).Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали с использованием набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя до 1 мкг общей РНК. Для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) использовали полимеразу Herculase II (Agilent Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную ОТ-ПЦР (qRT-PCR) проводили в системе StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific) с использованием SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.Относительные уровни экспрессии Cnga1 и Opn1mw были нормализованы к гену домашнего хозяйства Alas и рассчитаны с использованием метода 2 ^{-ΔΔC (T)} . Все праймеры, использованные в этом исследовании, можно найти в таблице S1.

Выделение РНК, подготовка библиотеки mRNA-seq и секвенирование

Полную РНК выделяли из сетчатки с использованием набора RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN) в соответствии с протоколом производителя. Для производства библиотеки мРНК мы использовали расширенную версию протокола SMARTseq2.Вкратце, ок. От 7 до 90 нг общей РНК, мРНК улавливали смесью 0,5 мкл 20 мкМ oligo dT праймера и 0,5 мкл 20 мМ dNTP с последующим нагреванием до 72 ° C в течение 3 минут и немедленным помещением в баню с ледяной водой. Затем в 10-мкл реакции получали двухцепочечную кДНК путем добавления 2 мкл буфера для первой цепи 5 × Superscript II (ThermoFisher Scientific), 2 мкл 5 М бетаина, 0,6 мкл 100 мМ MgCl ₂ , 0,5 мкл 100 мМ дитиотреитола (DTT), 0,4 мкл РНКзина (Promega), 0,5 мкл 20 мкМ олиго-переключателя матрицы (20 мкМ) и 0.5 мкл обратной транскриптазы SuperScript II (200 Ед / мкл; ThermoFisher Scientific) и инкубация в течение 90 минут при 42 ° C, затем 14 циклов (50 ° C в течение 2 минут, 42 ° C в течение 2 минут) и тепловая инактивация (70 ° C в течение 15 мин). Преамплификацию выполняли путем добавления 12,5 мкл смеси 2 × KAPA HiFi HotStart Ready, 0,25 мкл 10 мкМ праймеров IS для ПЦР и 2,25 мкл воды, свободной от нуклеаз, в термосе при 98 ° C в течение 3 мин, 10 проб. -циклы усиления (98 ° C в течение 20 секунд, 67 ° C в течение 15 секунд, 72 ° C в течение 6 минут), затем 5 минут при 72 ° C и выдержка при 4 ° C.Очистку проводили с помощью гранул AMPure XP (Beckman Coulter), количественно определяли кДНК с помощью Qubit (ThermoFisher Scientific) и проверяли распределение длины фрагментов на чипе Agilent Bioanalyzer. Затем 7 нг кДНК фрагментировали в реакционной смеси объемом 20 мкл путем инкубации с 1 мкл фермента Tn5 из набора для подготовки библиотеки Illumina Nextera и 10 мкл 2-кратного буфера для мечения ДНК в течение 10 мин при 55 ° C. Меченую кДНК очищали на колонках MinElute (QIAGEN) и амплифицировали с помощью ПЦР с NEBNext High-Fidelity 2 × PCR Mastermix, по 1 мкл каждого 10 мкМ праймера Nextera index 1 и Nextera index 2 (Illumina) с протоколом термоса 72 ° C для 5 минут, 98 ° C в течение 30 секунд, 7 циклов (98 ° C в течение 10 секунд, 63 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 1 минуты), 72 ° C в течение 5 минут и выдержка при 4 ° C.Конечную библиотеку очищали с помощью гранул AMPure, количественно определяли с помощью Qubit и секвенировали для 100 пар оснований с использованием проточной кюветы с однократным считыванием V3 на HiSeq 2500 (Illumina). Сгенерированные данные были обрезаны для обеспечения качества, а адаптер считывал с помощью TrimGalore! а затем нанесено на карту с помощью выравнивателя STAR. Дубликаты были отмечены с помощью функции MarkDuplicates из инструментов Picard. Считывания суммировали с помощью программного обеспечения RSEM (RNA-seq путем максимизации ожидания), а матрицу подсчета FPM (количество фрагментов на миллион картированных фрагментов) генерировали с помощью DESeq2.

Иммуноцитохимия

Для иммуноцитохимии клетки 661W-pb или MEF-pb высевали на стерильные покровные стекла диаметром 12 мм, покрытые гидробромидом поли-l-лизина (Sigma-Aldrich). После 48 часов применения DOX клетки фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich) и в течение 30 минут подвергали проницаемости в 0,3% Triton X-100. Затем покровные стекла инкубировали с блокирующим раствором (5% ChemiBLOCKER, Merck Millipore). Для окрашивания на Cnga1 и Sp Cas9 в клетках 661W-pb использовалось мышиное моноклональное антитело против Cnga1 (1:30; подарок от R.Molday) ( 31 ) и кроличьи поликлональные антитела против Sp Cas9 (1: 1000; C15310258, Diagenode), соответственно. Чтобы окрашивать M-опсин и Sp Cas9 в клетках MEF-pb, кроличьи поликлональные антитела против опсина красный / зеленый (M-опсин) (1: 300; AB5405, Merck) и мыши против Sp Cas9 моноклональные антитела (1: 500; SAB4200751, Sigma-Aldrich) соответственно. Раствор Hoechst 33342 (5 мкг / мл; Invitrogen, ThermoFisher Scientific) использовали для окрашивания ядер.Изображения были получены с помощью спектрального конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP8 (Leica), получены с помощью программного обеспечения LASX (Leica) и затем обработаны с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения).

Измерения «пластырь-зажим»

«Наизнанку-наружу» вырезали пластыри из 661W стабильных клеток, которые поддерживали при концентрации DOX 5 нг / мл. Токи регистрировали с использованием усилителя с двойным патч-зажимом EPC-10 (HEKA Elektronik, Harvard Bioscience) и программного обеспечения для сбора данных PatchMaster (HEKA Elektronik, Harvard Bioscience).Данные оцифровывались с частотой 20 кГц и фильтровались с частотой 2,9 кГц. Все записи были получены при комнатной температуре. Внеклеточный раствор состоял из 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ Hepes и 1 мМ EGTA (pH 7,4). Внутриклеточный раствор содержал 140 мМ KCl, 5 мМ NaCl, 10 мМ Hepes и 1 мМ EGTA (pH 7,4). Эффект цГМФ исследовали путем перфузии пластыря внеклеточным раствором с добавлением 300 мкМ цГМФ. Для исследования блокировки каналов была проведена перфузия симметричным раствором Ca ^{2 + /} Mg ²⁺ , состоящим из 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl ₂ , 1 мМ MgCl ₂ и 10 мМ Hepes. с последующей перфузией раствором Ca ²⁺ / Mg ²⁺ с добавлением цГМФ в качестве контроля.Токи вызывались удерживающим потенциалом 0 мВ путем применения 300-миллисекундного импульса -80 мВ с последующим 300-миллисекундным импульсом 80 мВ каждые 3 с.

Лизаты ТХ и вестерн-блоттинг

Кратковременно трансфицированные клетки HEK293 собирали через 48 часов после трансфекции и лизировали в буфере для лизиса ТХ (0,5% Тритон Х-100, об. / Об.) С использованием смесительной мельницы MM400 (Retsch). Буфер для лизиса дополняли таблетками cOmplete ULTRA Protease Inhibitor Cocktail (Roche). Для вестерн-блоттинга 30 мкг цельноклеточного белка инкубировали в 1 × буфере для образцов Лэммли с добавлением DTT при 72 ° C в течение 10 мин.Белки разделяли на 6-12% SDS-полиакриламидном геле с помощью гель-электрофореза. Для иммуноблоттинга использовали антитело против Sp Cas9 (1: 1000; C15310258, Diagenode). Относительные интенсивности полос были количественно определены с использованием программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad).

продуцирование rAAV и субретинальные инъекции

векторов rAAV, содержащих N- или C-концевую часть dCas9-VPR и кассету экспрессии sgRNA, получали с использованием капсида 2 / 8YF ( 32 ), как описано ранее ( 33 , 34 ).Мышам C57Bl / 6J инъецировали субретинально на Р28 с помощью одной инъекции (1 мкл) rAAV с соответствующим титром (всего 10 ¹¹ мкг / мкл), и сетчатки собирали для иммуногистохимии через 4 недели после инъекции. 10 мышам Rho ^+/- в один глаз вводили одну инъекцию (1 мкл) rAAV с соответствующим титром (всего 10 ¹¹ мкг / мкл) на P14. Контралатеральный глаз инъецировали 1 мкл NaCl (физиологический раствор). Через двенадцать месяцев после инъекции ЭРГ и ОКТ были выполнены на обоих глазах всех мышей Rho ^+/- , и все сетчатки были собраны для иммуногистохимии.

Электроретинография

Электроретинограммы роговицы были записаны у 10 мышей Rho ^+/- и 10 мышей C57Bl / 6J WT соответствующего возраста с использованием полнопольной ERG-системы Celeris от компании Diagnosys (модель D430). Для каждого животного проводили скотопические и фотопические электроретинограммы. Мышей адаптировали к темноте в течение ночи, и сначала проводили измерения скотопической ERG в условиях тусклого красного света, а затем проводили фотопические тесты. Зрачки расширяли с помощью глазных капель, содержащих 1% атропин и 0,5% тропикамид (Mydriaticum Stulln, Pharma Stulln GmbH).В качестве контактной жидкости перед установкой световодных электродов на оба глаза наносили гидроксилпропилметилцеллюлозу (Methocel 2%, OmniVision GmbH). В течение всего протокола животные содержались в тепле с помощью встроенного нагревателя платформы системы Celeris. Ответы ERG были получены одновременно от обоих глаз. Для скотопических измерений записи одиночной вспышки выполнялись при интенсивности света 0,003 (синий свет, 455 нм), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 и 10 кд.с / м ² (все остальные интенсивности 6500 К. белый свет).Интенсивность фона составила 0 кд / м ² . Для фотопических измерений мышей адаптировали к свету (3 кд.с / м ² ) в течение 5 минут, и записи одиночной вспышки получали при интенсивности света 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 и 10 кд.с / м ² . Интенсивность фона для всех фотопиксельных записей составляла 9 кд / м ² . Как для скотопической, так и для фотопической оценки измерения регистрировались от 50 мс до начала стимула до 300 мс после стимула. Сигналы напряжения были дискретизированы с частотой 1 Гц, и зарегистрированные отклики представляли собой средние значения 5 (скотопический) или 10 (фотопический) разверток в зависимости от отношения сигнал / шум.Измерения были проанализированы с использованием прилагаемого программного обеспечения Espion V6 от Diagnosys с амплитудой a-волны, измеренной от начала стимула до впадины a-волны, и амплитудой b-волны в диапазоне от впадины a-волны до пика b-волна.

Оптическая когерентная томография

Морфология сетчатки мышей Rho ^+/- была оценена с помощью ОКТ с использованием адаптированной системы Spectralis HRA + OCT (Heidelberg Engineering) в сочетании с контактными линзами, как описано ранее ( 35 ).Зрачки расширяли с помощью глазных капель, содержащих 1% атропина и 0,5% тропикамида (Mydriaticum Stulln, Pharma Stulln GmbH), и наносили гидроксилпропилметилцеллюлозу (Methocel 2%, OmniVision GmbH), чтобы глаза оставались влажными. ОКТ-сканирование (20 кадров на сетчатку) выполнялось в режиме высокого разрешения со сканером, установленным на поле зрения 30 °.

Иммуногистохимия и конфокальная микроскопия

Сетчатки 13-месячных мышей Rho ^+/- , которым вводили инъекцию, и мышей WT соответствующего возраста вскрывали и обрабатывали для иммуногистохимии, как описано ранее ( 36 ).Мышиное моноклональное антитело против PRPh3 2B7 (1: 100; подарок М. Naash) ( 37 ) служило маркером для внешних сегментов палочек и колбочек. Антитело морской свинки против iba1 (1: 100; 234 004, Synaptic Systems) использовали для визуализации микроглии. Маркер потенциального реактивного глиоза служило мышиное антитело против GFAP-Cy3 (1: 1000; C9205, Sigma-Aldrich). Конъюгированный с флуоресцеином изотиоцианат лектин из Arachis hypogaea [агглютинин арахиса (PNA)] (1: 100; L7381, Sigma-Aldrich) применяли для окрашивания фоторецепторов колбочек.Для обнаружения конус-специфичного и активированного М-опсина в фоторецепторах палочек использовали кроличьи антитела против опсина красный / зеленый (М-опсин) (1: 300; AB5405, Merck). Ядра клеток визуализировали раствором Hoechst 33342. Для обнаружения апоптоза анализ TUNEL проводили с использованием набора для обнаружения гибели клеток in situ, флуоресцеин (11684795910; Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Тест TUNEL был проведен на 8 из 10 инъецированных мышей Rho ^+/- , за исключением мышей № 7 и № 8 (фиг. 6), поскольку у этих двух мышей не осталось криосрезов для окрашивания.Изображения сетчатки получали с помощью спектрального конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP8 (Leica), получали с помощью программного обеспечения LASX (Leica) и затем обрабатывали с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения). Посмертный анализ толщины ONL в окрашенных срезах сетчатки проводили с использованием программного обеспечения ImageJ. Для анализа были выбраны участки на равном расстоянии от зрительного нерва. По сетчатке усреднялось не менее трех измерений.

Статистика

Все значения даны как средние значения ± SEM.Количество повторов ( n ) и использованные статистические тесты указаны в легенде каждого рисунка для каждого эксперимента.

Благодарности: Мы благодарим Б. Ноака, Дж. Коха и К. Скоканна за отличную техническую поддержку. Мы также благодарим M. Naash за дар антитела к периферину-2 и R. Molday за подарок антитела CNGA1. Кроме того, мы хотим поблагодарить М. Аль-Убайди за подарок батарей 661W. Финансирование: Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft, SPP2127 (E.Б., М. Б. и С. М.). K.J.V.N. был профинансирован грантом BMBF (031L0101D) для de.NBI и в настоящее время нанимается AstraZeneca. Эта работа также была частично поддержана грантами Немецкого исследовательского фонда SFB 870 B05. Вклад авторов: E.B. разработал исследование и руководил проектом при участии С.М. и М. С. провели эксперименты in vivo, включая получение AAV, субретинальные инъекции, ОКТ, иммуногистохимию и эксперименты с ERG при участии V.S., L.M.R., J.E.W. и K.S.H. ПРОТИВ. разработал и создал стабильные клеточные линии, провел иммуноцитохимические исследования и эксперименты по молекулярной биологии, включая дизайн sgRNA, qRT-PCR и статистический анализ при участии S.B. и L.M.R. R.D.R. выполнили и проанализировали измерения патч-зажимов при участии C.W.-S. и С.Ф. Г.Г. выполнили эксперимент RNA-seq и K.J.V.N. проанализировали данные RNA-seq. Э.Б., В.С., С.Б., Л.М.Р. написал рукопись при участии С. и М. Э.Б., С. М., М. Б., К. В.-С. и Дж. У. полученное финансирование. Э.Б., С.М., М.Б., С.Б., В.С. и Л.М.Р. проанализировали и обсудили данные при участии всех авторов. Конкурирующие интересы: E.B., M.B. и S.M. являются авторами заявки на патент, связанной с этой работой (№ EP19198830, поданной 23 сентября 2019 г.). Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах.Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

• Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

Министр образования Татарстана о вакцинации от COVID-19 — Реальное время

Рекордное количество медалистов, не подтвердивших свои знания при поступлении в вузы

Назначенный менее 3 месяцев назад глава Минобрнауки Татарстана Ильсур Хадиуллин подвел итоги года в сфере образования на своей первой пресс-конференции в новой должности.Он объявил об открытии образовательного центра «Сириус» в Казани, Дома научного сотрудничества в Елабуге и двух центров повышения квалификации учителей, пообещал, что вакцинация учителей от COVID-19 будет только добровольной, а госэкзамены отменять не будут. . Как изменилась заработная плата классных руководителей, будет ли решена проблема второй смены в следующем году, как дистанционное обучение повлияло на качество обучения и нужно ли у министра профильное образование — читайте в материале «Реального времени».

Встречу с журналистами министр начал с краткого подведения итогов года и обсуждения планов на будущее. Несмотря на сложности в связи с пандемией коронавируса, в Татарстане продолжилась реализация национального проекта «Образование». На эти цели потрачено более 80 миллиардов рублей. В Казани построены две школы: полиязычная школа на улице Бондаренко и общеобразовательная школа на улице Жиганова, 42 сельские школы стали центрами цифрового и гуманитарного профилей Point of Growth и получили соответствующее оборудование, в том числе шахматные зоны.По словам министра, в 2021 году такими зонами будут оборудованы еще 114 школ, а в будущем они появятся во всех образовательных учреждениях республики.

По другим программам нацпроекта отремонтировано шесть спортивных залов, в Набережных Челнах открылся детский парк «Кванториум», 25 декабря открывает свои двери образовательный центр «Сириус», на оборудование которого потрачено более 336 миллионов рублей. Дети со всей страны приедут на него не только для подготовки к олимпиадам, но и для участия в различных образовательных, культурных и спортивных мероприятиях.

В рамках проекта «Успех каждого ребенка» в Елабуге откроется Дом научного сотрудничества на базе местного филиала Казанского федерального университета (КФУ), где студенты получат возможность изучать естественные науки. Семьдесят восемь образовательных учреждений республики стали участниками проекта «Цифровая образовательная среда», на базе Альметьевского политехнического техникума создан Центр цифрового образования.

Также впервые в республике открываются центр непрерывного профессионального роста учителей и центр оценки компетенций педагогических менеджеров для повышения квалификации учителей. Министр подчеркнул, что оба центра будут давать независимую оценку профессиональных навыков учителей, но никто не будет заставлять их в обязательном порядке сдавать «Единый государственный экзамен для учителей».

Министр образования Татарстана пообещал не заставлять учителей делать прививки от COVID-19, вакцинация в республике будет для них добровольной.

«Никакого принуждения со стороны Минобрнауки не будет, все в декларативном порядке. Чтобы сделать прививку, учителя сдают огромное количество тестов, и есть разные факторы. Если они пройдут все эти этапы и получат зеленый свет от врачей, то смогут спокойно проводить вакцинацию », — пояснил Ильсур Хадиуллин.

По его словам, в республике уже началась вакцинация учителей.

В Татарстане госэкзамены в этом году отменять не будут.

«Мы очень надеемся, что сейчас ситуация изменится, и с 24 мая начнем сдавать ЕГЭ в основной семестр. Это для регионов, перешедших на дистанционное обучение, учебный год будет продлен. . Но для нас такой угрозы нет. Наша программа идет по плану. Мы надеемся, что сдадим госэкзамены вовремя », — сказал министр, отвечая на вопрос« Реального времени ».

Однако одиннадцатиклассников ждут перемены, связанные с пандемией. По словам министра, написание итогового сочинения по русскому языку в 11 классах перенесено с декабря на 5 мая. Есть еще резервные дни — 11, 18, 19 мая. И собеседование на русском языке на 9-е. Классы будут проходить в двух форматах: дистанционном (для тех, кто перешел на дистанционное обучение) и в обычном очном, но будет ограничен 15 минутами.

В прошлом учебном году из-за пандемии коронавируса был отменен Основной государственный экзамен, а государственная итоговая аттестация в 11 классах проводилась как вступительный экзамен в высшее учебное заведение.

В Татарстане с начала учебного года 209 000 учеников начальных классов получают бесплатное горячее питание. На это выделено 860 миллионов рублей, из них 58% оплачивает бюджет Российской Федерации и 42% — Казначейство республики.Хадиуллин подчеркнул, что у регионов была возможность отложить реализацию предложения президента Путина до 2023 года, а в Татарстане — нет.

Министр отметил, что качество питания вызывает вопросы у родителей, общественности, самих детей, и самокритично признал, что «проблема не решена полностью». Но республика выделила 1 миллиард рублей на модернизацию пунктов школьного питания. «Нигде таких программ нет!» Хадиуллин похвастался.Он добавил, что в Татарстане с 2012 года реализуется программа капитального ремонта образовательных учреждений, которая не свертывалась даже во время свирепого коронавируса, согласно которой школьные столовые также приводятся в современный вид.

В этом году учителя начали получать доплаты за классное руководство. 550 рублей — базовая ставка, плюс 80 рублей — на каждого ребенка и еще 5 000 рублей — сама федеральная выплата. Всего учитель может «иметь» до 8000 рублей сверх заработка в месяц.

Министр подчеркнул, что не согласен с мнением о плохой работе классных руководителей. Просто когда в классе до 40 человек, это большая нагрузка для учителя.По словам Хадиуллина, школа наставничества может помочь молодым кадрам. У классных учителей есть собственный чат, в котором они обсуждают проблемы, а опытные учителя публикуют советы для начинающих классных учителей.

В настоящее время во второй смене обучается более 50 000 детей или 11% от общего числа школьников республики. В образовательных учреждениях Татарстана нет третьей смены. Министр признал, что за один год проблему не решить.

Решить проблему второй смены можно только с вводом новых школ. В этом году сданы в эксплуатацию семь школ и две хозяйственные постройки в Казани, Чистополе, Елабуге, Альметьевске, Пестрецах. Однако строительство учебных заведений предусмотрено в районах с новым интенсивным развитием. Например, одна школа уже готова к открытию в Салавате Купере, а вторая будет построена в 2021 году.

Также в следующем году планируется построить 13 детских садов почти на 3000 мест.

Министр признал, что дистанционное обучение плохо сказалось на качестве образования. «Это была большая ошибка с нашей стороны», — сказал он. В этом году из-за отмены единого государственного экзамена в республике прибыло беспрецедентное количество выпускников-медалистов. Но на государственных экзаменах в вузах некоторые из по профильным предметам они не набрали даже 70 баллов.

И это еще без учета результатов Всероссийских проверочных работ (ВПР), которые написали этой осенью ученики 4, 5, 8 и 10 классов. «Мы еще не получили результатов из Москвы, но уверены, что есть трудности с написанием ВКМ», — сказал Хадиуллин.

Единственное утешение — то, что в этом году в Татарстане мало школ, где контрольные работы учащихся были необъективными.

Минобразования признало проблемы с подготовкой кадров в российских и зарубежных вузах и научных организациях по программе «Алгарыш».Многие люди, повысив квалификацию, либо не возвращаются в республику, либо не могут найти работу.

Министр заверил, что следит за присутствием студентов и аспирантов, и отметил, что трудности возникают, в том числе, из-за того, что некоторые стажеры отказываются от предложенных мест.

На вопрос, как работают школы по предотвращению «коломбины», Ильсур Хадиуллин сказал, что посты детей в социальных сетях никто не отслеживает — так должно быть. сделано другими органами.В основном все ложится на плечи классных руководителей. Им должен помочь ежегодный мониторинг психологического состояния детей, выявляющий группы риска.

«У классного руководителя есть фотография. Эту картинку должен знать только один классный руководитель вместе со школьным психологом, потому что это информация для проведения воспитательной работы с этим ребенком. И, конечно же, родители должны знать. Мы работаем в таком формате », — сказал заведующий отделением.

Ну, родители сами должны следить за тем, что делает их ребенок в сети.В сложных случаях рекомендуется обращаться к школьному психологу или в республиканский центр психолого-педагогической реабилитации и коррекции Росток, координаты которого можно узнать во всех учебных заведениях.

«Но было бы здорово, если бы родители сами обратили внимание на такие моменты. Потому что иногда в одной квартире, в одном доме они не общаются друг с другом. Все погружены в виртуальный мир. Ребенок с телефоном, отец с айфоном, мама на кухне с айпадом, и они не встречаются.Нам не нужна федеральная программа, чтобы их объединить и создать среду для общения.

Хадиуллин, назначенный на эту должность менее трех месяцев назад, ответил на каверзный вопрос, нужно ли министру профильное образование. «Сможете ли вы руководить министерством сельского хозяйства?» — спросил один из журналистов, имея в виду базовое сельскохозяйственное образование последних министров — Энгеля Фаттахова и Рафиса Бурганова.

«Те предшественники, которые возглавляли министерство образования, смогли сохранить добрые традиции, заложенные в нашем министерстве и в системе образования в целом. Каждый работает в своей сфере и несет свою ношу … Я начал работать 25 сентября, я отвечаю за систему образования и постараюсь сделать и учителей, и родителей счастливыми, что они живут и работают в этой системе … Я понимаю ваш вопрос, Я бы ответил на это », — министр дипломатично уклонился от прямого ответа.

y Элеонора Рылова

Piscataway HS Seniors делятся советами о том, как выжить в старшей школе

ПИСКАТАУЭЙ, Нью-Джерси. В преддверии нового года обучения некоторые старшеклассники средней школы Пискатауэй представили свой виртуальный семинар «Как выжить в старшей школе», чтобы дать совет, как добиться успеха в старшей школе.

во вторник была организована библиотекарями Piscataway Teen Services, Кейт-Линн Браун и Эрикой Кривопал.В группу старших докладчиков PHS вошли Кейтлин Лю, Асия Макаллистер, Ом Патель и Колби Ройстон, которые обсудили, как поступающие старшеклассники могут добиться успеха во всех доступных им классах и мероприятиях.

«Курсы повышения квалификации (AP) могут помочь вам сэкономить деньги и время в колледже», — сказала Кейтлин Лю ученикам средних и старших классов, которые вошли в видеовстречу Zoom. «Начните готовиться к экзамену ACT / SAT заранее и постарайтесь пройти 2–3 практических теста.Начало вашего младшего года — хорошее время для начала ».

Подпишитесь на рассылку новостей Piscataway

Наш информационный бюллетень доставляет местные новости, которым вы можете доверять.

Вы успешно подписались на информационный бюллетень TAPinto Piscataway.

Библиотекари напомнили участникам программы о ресурсах для подготовки к тестам, которые доступны бесплатно в публичной библиотеке Пискатауэя, включая стратегическую сессию ACT / SAT в среду, 23 сентября.

Азия Макаллистер сосредоточила внимание на важности поддержания хороших отношений с учителями и на том, как учащиеся должны воспользоваться дополнительными кредитными возможностями, которые могут помочь их оценкам.

«Это как страхование жизни», — сказал Макаллистер.

«Не расстраивайтесь, если вы получите плохую оценку … учитесь на своих ошибках», — рекомендовал Ом Патель. «Кроме того, не бойтесь высказываться, делиться своими идеями и брать на себя некоторые руководящие роли, когда это возможно».

Колеби Ройстон отметил, что студенты должны стараться вступать в клубы, которые связаны с их интересами или карьерой.

«Используйте свой первый год обучения, чтобы опробовать разные клубы, чтобы узнать, что вам нравится, но помните, что лучше показать свою приверженность, а не множественность», — сказал Ройстон.

Старшие участники дискуссии предложили и другие советы по ориентированию в старшей школе, в том числе проявить настойчивость, иметь позитивный настрой, познать себя и то, с чем можно справиться, и окружить себя друзьями, которые поддерживают и поддерживают.

Чтобы ознакомиться с описанием клубов, доступных для учащихся средней школы Пискатауэй, щелкните здесь. Студенты должны обратиться к консультантам клуба, если у них возникнут какие-либо вопросы.

TAPinto является бесплатным и публикуется ежедневно благодаря спонсорству и рекламе.

Получайте новости вашего города в свой почтовый ящик: Щелкните здесь , чтобы зарегистрироваться. Свяжитесь с [email protected] для спонсорской и рекламной информации.

Пандемия привела к сокращению персонала в Вашингтонском павильоне

Несколько сотрудников Вашингтонского павильона остались без работы. Президент и главный исполнительный директор Даррин Смит говорит, что из-за пандемии из-за пандемии пришлось уволить сотрудников.Павильон недавно отменил сезон выступлений на Бродвее на 2020-2021 годы.

Двери открыты, знаки приветствия подняты. Но, как и многие другие некоммерческие организации, Вашингтонский павильон не так загружен, как год назад.

«Может пройти пара лет, прежде чем мы вернемся туда, где мы были до пандемии», — сказал Смит.

Смит говорит, что Павильон сократил штат на 25 процентов за счет увольнений, увольнений и сокращения рабочего времени.
До пандемии, по словам Смита, было около 130 сотрудников.Если вы проделаете математику с этими двумя числами, в итоге получится около 32 человек. Однако Смит говорит, что не может подтвердить конкретную цифру.

Брэди Мэллори : Сколько людей составляет 25 процентов?
Смит: Что ж, в том-то и дело. Я действительно не могу назвать вам номер. Это тот, кто работает на концессионном стенде пять часов в неделю. Это человек, который работает 30 часов в неделю. Это полный рабочий день.

Из-за пандемии сократилось количество денег, которые приносит Вашингтонский павильон, и количество необходимых сотрудников.