Результаты эволюции: многообразие видов и приспособленность организмов к среде обитания. Видеоурок. Биология 9 Класс

Затем мы исследовали статус делеции для других генов, участвующих в доместикации O. sativa . Мы сосредоточились на генах, которые ранее были вовлечены в начальную фазу одомашнивания риса [11], где гены были отобраны во время трансформации дикого риса в одомашненный рис — i.е., Rc (Os07g0211500) [19], Bh5 (Os04g0460200) [69], PROG1 (Os07g0153600) [70], OsC1 (Os06g0205100) [71] (Os06g0205100) [71], 72], GS3 (Os03g0407400) [73], qSh2 (Os01g0848400) [20] и qSW5 (Os05g0187500) [62]. Наша цель состояла в том, чтобы сделать выводы о том, могла ли история одомашнивания риса циркум-басмати отличаться от истории других субпопуляций риса. Результаты показали, что ни один из этих генов не был удален в популяции циркум-басмати (дополнительный файл 2: таблица S8).Это говорит о том, что в отличие от процесса одомашнивания африканского риса ( O. glaberrima [74]), делеции генов не были основным фактором во время начальной фазы одомашнивания риса циркум-басмати. Вероятно, многие делеции гена, которые были отобраны во время одомашнивания риса циркум-басмати, произошли в период культивирования [11], когда кулинарные или культурные предпочтения были отобраны для уникальных специфических черт циркум-басмати.

Повторяющаяся ДНК и динамика ретротранспозонов в геномах циркум-басмати

Повторяющаяся ДНК составляет более 44% совокупностей геномов басмати 334 и дом-суфидов (Таблица 2).В соответствии с геномами других видов растений [75], повторяющаяся ДНК в основном состоит из ретротранспозонов класса I, за которыми следуют транспозоны ДНК класса II (рис. 4a). Всего было аннотировано 171,1 МБ как повторяющиеся для Basmati 334 и 169,5 МБ для Dom Sufid. Количество повторяющейся ДНК в геномах циркум-басмати было выше, чем в геномах Nipponbare (160,6 МБ) и N22 (152,1 МБ), но ниже, чем в геномах индика R498 (175,9 МБ) и IR8 (176,0 МБ). Эти различия в общем количестве повторяющейся ДНК были сходны с общими различиями в размере сборки генома (Таблица 3), указывая на то, что вариации в накоплении повторяющейся ДНК в значительной степени определяют различия в размере генома у риса [76].

Повторяющийся ландшафт ДНК геномов басмати 334 и дом суфидов. a Доля повторяющегося содержания ДНК в геномах с описанием басмати, представленных каждым семейством повторов. b Распределение времени вставки ретротранспозонов gypsy и copia LTR. c Филогения ретротранспозонов gypsy и copia LTR на основе гена rve . Ретротранспозоны LTR были аннотированы из эталонных геномов одомашненного и дикого риса

Мы сосредоточили наше внимание на ретротранспозонах, которые составляли большую часть ландшафта повторяющейся ДНК риса (рис.4а). Используя LTRharvest [77, 78], мы идентифицировали и аннотировали de novo ретротранспозоны LTR в геномах циркум-басмати. LTRharvest аннотировал 5170 и 5150 кандидатов LTR ретротранспозонов в Basmati 334 и Dom Sufid, соответственно (дополнительный файл 2: таблицы S10 и S11). Из них 4180 ретротранспозонов (80,9% всех ретротранспозонов-кандидатов LTR) в Basmati 334 и 4228 (82,1%) в Dom Sufid были классифицированы как ретротранспозоны LTR с помощью инструмента RepeatMasker ‘s RepeatClassifer (http: // www.repeatmasker.org). Большинство ретротранспозонов LTR происходило из суперсемейств gypsy и copia [79, 80], что составляло 77,1% (3225 gypsy элементов) и 21,9% (915 элементов copia ) ретротранспозонов LTR в геноме Basmati 334. и 76,4% (3231 gypsy элементов) и 22,8% (962 copia элементов) LTR ретротранспозонов в геноме Dom Sufid, соответственно. Сравнение содержания ретротранспозона LTR среди эталонных геномов из разных групп сортов риса (дополнительный файл 1: рисунок S5) показало, что сборка геномов почти завершена (т.е., Nipponbare, N22, Basmati 334, Dom Sufid и сорта индика IR8 и R498, а также MH63 и ZS97 [40]) имели большее количество аннотированных ретротранспозонов, чем геномы, полученные на основе данных короткого чтения (GP295-1, Circum-aus разновидности DJ123 [38] и Kasalath [39], а также разновидность индика IR64 [38]), предполагая, что в сборках генома из данных коротко читаемого секвенирования могут отсутствовать определенные повторяющиеся участки ДНК.

Благодаря механизму пролиферации транспозонов LTR, расхождение ДНК последовательности LTR может использоваться для приближения времени встраивания ретротранспозона LTR [81].По сравнению с другими эталонными геномами риса время встраивания ретротранспозонов Basmati 334 и Dom Sufid LTR было наиболее сходным с тем, которое наблюдалось для элементов в геноме N22, охватывающем окружность (дополнительный файл 1: Рисунок S5). В наших ансамблях циркум-басмати элементы суперсемейства gypsy имели более молодое среднее время вставки (~ 2,2 миллиона лет назад), чем элементы суперсемейства copia (~ 2,7 миллиона лет назад; рис. 4b).

Сконцентрировавшись на элементах gypsy и copia с геном rve (интеграза; Pfam ID: PF00665), мы исследовали эволюционную динамику этих ретротранспозонов LTR, реконструировав их филогенетические отношения в эталонных геномах четырех домашних сортов риса. группы (N22, Basmati 334, Dom Sufid, R498, IR8 и Nipponbare) и два диких вида риса ( O.нивара и О. rufipogon ; Рис. 4в). Ретротранспозоны сгруппированы в отдельные филогенетические клады, которые, вероятно, отражают повторы, принадлежащие одному семейству или подсемейству [82]. Большинство филогенетических клад обнаруживают короткие внешние и длинные внутренние ветви, что согласуется с быстрыми недавними всплесками транспозиции, наблюдаемыми в различных семействах ретротранспозонов LTR риса [83].

Суперсемейства gypsy и copia каждое содержат кладу, в которой большинство элементов происходит из O.sativa , и присутствует только среди четырех групп одомашненных сортов риса (рис. 4c, одна звездочка; координаты их генома см. в дополнительных файлах 2: таблицы S12 и S13). Элементы в филогенетической кладе суперсемейства gypsy имели сходство последовательностей (963 из 1837 ретротранспозонов) с элементами семейства hopi [84], тогда как элементы филогенетической клады суперсемейства copia имели сходство последовательностей (88 из 264) к элементам семейства osr4 [85].Элементы семейства hopi обнаружены в большом количестве копий в геномах одомашненных сортов риса [86], и эта амплификация произошла недавно [87].

Некоторые клады ретротранспозонов были ограничены определенными группами сортов риса. Суперсемейство gypsy содержало филогенетическую кладу, элементы которой присутствовали только в геномах разновидностей циркум-аус, циркум-басмати и индика (рис. 4c, двойная звезда; координаты генома см. В дополнительном файле 2: таблица S14), тогда как мы наблюдали кладу, состоящую в основном из специфичных для циркум-басмати элементов внутри надсемейства copia (рис.4c, тройная звезда; их геномные координаты см. в Дополнительном файле 2: Таблица S15). Лишь несколько представителей клады gypsy -like имели сходство последовательностей (7 из 478) с элементами семейств rire3 [88] и rn215 [89]. Известно, что члены обоих семейств присутствуют в большом количестве копий в геномах одомашненных сортов риса, но их количество различается между группами сортов japonica и indica [86], что свидетельствует о расширении rire3 — или rn215 -подобных элементов в геномы циркум-ауса, циркум-басмати и индика.Большинство специфичных для циркум-басмати элементов copia имели сходство последовательностей (109 из 113) с членами семейства houba [84], которые обнаруживаются в большом количестве копий у некоторых людей, но в меньшем частота в популяции риса [86]. Это предполагает, что семейство houba могло недавно подвергнуться расширению, особенно в геномах циркум-басмати.

Филогеномный анализ происхождения риса циркум-басмати

Мы оценили филогенетические отношения внутри и между группами сортов одомашненного азиатского риса.Наше филогенетическое дерево максимального правдоподобия, основанное на четырехкратно вырожденных сайтах из кодирующих последовательностей Nipponbare (рис. 5a), показало, что каждый сорт был монофилетическим по отношению к группе разновидностей своего происхождения. Кроме того, группа циркум-басмати была сестрой японского риса, а группа циркум-аус была сестрой индики. В соответствии с предыдущими наблюдениями, дикий рис O. nivara и O. rufipogon были сестрами риса Circum-aus и японского, соответственно [14].Хотя это предполагает, что каждая группа одомашненных сортов риса могла иметь независимых диких предков происхождения, следует отметить, что недавняя гибридизация дикого и одомашненного риса [90, 91] могла привести к сходным филогенетическим отношениям.

Сравнительный геномный анализ эволюции риса циркум-басмати. Группы сортов Oryza sativa обозначены как циркум-аус (cA), циркум-басмати (cB), индика (I) и японская (J), а дикий родственник — O.руфипогон (R). a Дерево максимального правдоподобия на основе четырехкратно вырожденных сайтов. Все узлы имели поддержку начальной загрузки более 95%. b Процент генов, поддерживающих топологию, включающую японскую Nipponbare, циркум-басмати басмати 334 (B334) и Dom Sufid (DS), и O. rufipogon после теста с приблизительной несмещенностью (AU). c Результаты тестов ABBA-BABA. Показаны медианные значения D-статистики Паттерсона с 95% доверительными интервалами, определенные с помощью процедуры самонастройки.Для каждой протестированной топологии внешней группой всегда была O. barthii . d Процент генов, поддерживающих топологию, включающую циркум-аус N22, циркум-басмати и индика R498, после теста AU. e Распределение D-статистики по хромосомам для трио, включающей R498, N22 и каждый геном циркум-басмати. Полногеномная D-статистика с 95% -ным доверительным интервалом начальной загрузки показана темными и пунктирными линиями. f Модель событий примеси, которые произошли в одомашненном азиатском рисе.Направление смешения оставлено неоднозначным, поскольку тест ABBA-BABA не может определить направление потока генов

Для дальнейшего изучения филогенетических взаимоотношений между циркум-басмати и японикой мы исследовали филогенетические топологии каждого гена с участием трио Basmati 334, Nipponbare , и О. rufipogon . Для каждого гена мы проверили, какая из трех возможных топологий корневого трехвидового дерева — то есть [(P1, P2), P3], O, где O — внешняя группа O. barthii , а P1, P2 и P3 — Басмати 334 (или Дом Суфид), Ниппонбаре и О.rufipogon соответственно — были обнаружены в наибольшей доле. Для трио, включающего Basmati 334, Nipponbare и O. rufipogon , было 7581 ген (или 32,6%), а для трио, включающего Dom Sufid, Nipponbare и O. rufipogon , было 7690 генов (или 33,1%). %), который значительно отклонял одну топологию по сравнению с двумя другими с помощью теста на приблизительную несмещенность (AU) [92]. В обоих трио большинство этих генов поддерживают топологию, в которой циркум-басмати и ниппонбаре сгруппированы как сестры друг другу (рис.5b; 3881 [или 51,2%] и 4407 [или 57,3%] генов для Basmati 334 и Dom Sufid соответственно). Меньшее количество генов (3018 [или 39,8%] и 2508 [или 32,6%] генов для Basmati 334 и Dom Sufid, соответственно) поддерживало топологию, объединяющую Nipponbare и O. rufipogon .

Наш первоначальный тест топологии показал, что трио, включающее Дом Суфида, Ниппонбаре и O. rufipogon , имело более высокую долю генов, поддерживающих [(циркум-басмати, japonica), O.rufipogon ] по сравнению с тройкой, включающей Basmati 334, Nipponbare и O. rufipogon (рис. 5b). Это свидетельствует о внутрипопуляционных вариациях в количестве предков japonica или O. rufipogon в геномах циркум-басмати из-за различий в потоке генов. Для проверки интрогрессии мы использовали D-статистику из теста ABBA-BABA [93, 94]. Мы провели тесты ABBA-BABA с использованием топологии [(Basmati 334, Dom Sufid), Nipponbare или O. rufipogon ], чтобы изучить различия в интрогрессии между циркум-басмати и японикой или O.rufipogon геномов. Результаты показали достоверно положительную D-статистику для топологии [(Basmati 334, Dom Sufid), Nipponbare] (рис. 5c левая панель; z — оценка = 8,42 и D = 0,27 ± 0,032), что указывает на то, что Dom Sufid имеет больше аллелей с японикой, чем у басмати 334, из-за того, что в прошлом они больше смешивались с японикой. D-статистика, включающая топологию [(Basmati 334, Dom Sufid), O. rufipogon ], также была значимо положительной (рис. 5c, левая панель; z -оценка = 5.57 и D = 0,21 ± 0,038).

Сигнатуры смешения между геномами риса циркум-басмати и циркум-аус

Из-за обширного смешения геномов групп сортов риса [14] мы исследовали, влиял ли геном басмати поток генов с другими расходящимися группами сортов риса (т. Е. , циркум-аус или рис индика). Тест топологии был проведен для трехпопуляционного дерева видов с корнями. Для трио, включающего басмати 334, сорт Circum-Aus N22 и сорт индика R498, насчитывалось 7859 генов (или 35.3%), а для трио, включающего Dom Sufid, N22 и R498, было 8109 генов (или 37,8%), которые значительно отклоняли одну топологию по сравнению с двумя другими после теста AU. В обоих трио более половины генов поддерживали топологию группировки циркум-аус и индика как сестер (рис. 5d). Вдобавок большее количество генов поддерживало топологию группировки циркум-аус и циркум-басмати как сестер, чем топологию, группирующую индики и циркум-басмати как сестры. Это говорит о том, что группа разновидностей циркум-аус могла внести большую долю генов в циркум-басмати посредством потока генов, чем группа разновидностей индика.

Чтобы проверить наличие примеси, мы провели тесты ABBA-BABA с участием трио геномов циркум-басмати, N22 и R498. Результаты показали существенные доказательства наличия потока генов между циркум-байтом и обоими циркум-басматическими геномами — рис. 5в, правая панель; z — оценка = 5,70 и D = 0,082 ± 0,014 для топологии [(R498, N22), Basmati 334]; и z — оценка = 8,44 и D = 0,11 ± 0,013 для топологии [(R498, N22), Dom Sufid]. Чтобы проверить, была ли изменчивость в родословной циркум-ауса или индика в каждом из геномов циркум-басмати, мы провели тесты ABBA-BABA для топологии [(Basmati 334, Dom Sufid), N22 или R498].Ни один из тестов ABBA-BABA, включающих топологию [(Basmati 334, Dom Sufid), N22] (рис. 5c, правая панель; z — оценка = 1,20 и D = 0,025 ± 0,021) или топология [( Basmati 334, Dom Sufid), R498] (рис. 5c, правая панель; z — оценка = — 2,24 и D = — 0,06 ± 0,026), что свидетельствует о количестве примеси от циркум-ауса к каждому из два генома циркум-басмати были похожи.

Из-за значительного количества примесей, происходящих между циркум-аусом и циркум-басматигеномами, мы исследовали, повлияло ли это на топологический анализ, включающий трио японское, циркум-басмати и O.rufipogon (рис. 5б). В частности, мы оценили, было ли объединение japonica и O. rufipogon в качестве сестринских видов (рис. 5a) эволюционным артефактом из-за общих аллелей между циркум-басмати и циркум-аус посредством смешения. Мы проверили это, проведя тест AU на четырех популяциях, включающих циркум-аус, циркум-басмати (басмати 334 или дом суфид), японскую и O. rufipogon , проверяя, какая из 15 возможных топологий для корневой популяции с четырьмя корнями. образец (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S6 для 15 протестированных топологий) лучше всего подходит для каждого гена.Результаты показали, что было 2774 гена с участием Basmati 334 и 2665 генов с участием Dom Sufid, где тест AU значительно отклонял одну топологию по сравнению с другими 14 топологиями (дополнительный файл 1: рисунок S6). Наиболее частой топологией (> 30% генов) была та, что оба сгруппировали japonica и O. rufipogon как сестры и сгруппировали циркум-басмати и циркум-аус как сестры, что является топологией, которая возникает, когда между циркум-басмати и циркум-аус. На втором месте по частоте встречаемости (> 20% генов) была филогения вида (т.е., [(циркум-басмати, japonica), O. rufipogon ]), и это было представлено в пять раз выше, чем остальные 13 топологий. В конце концов, этот результат частично объясняет несоответствие между полногеномной топологией дерева (рис. 5a) и топологией специфичного для генов дерева (рис. 5b). Смешивание, происходящее между циркум-басмати и циркум-аусом, привело к ложной топологической взаимосвязи в масштабе всего генома.

В целом филогеномный анализ показал, что циркум-басмати и японская имеют общего последнего общего предка, тогда как циркум-басмати смешивались с циркум-басмати в течение своей эволюционной истории (рис.5е). Затем мы проверили, повлияла ли примесь из циркум-басмати на каждую из хромосом циркум-басмати в одинаковой степени. Для обоих геномов циркум-басмати большинство хромосом имело D-статистику, которая не отличалась от значения D-статистики для всего генома или от нуля (рис. 5e). Исключением были хромосомы 10 и 11, где D-статистика начальной загрузки была значительно выше, чем оценка для всего генома.

Популяционный анализ происхождения риса циркум-басмати

Поскольку наш анализ был основан на единичных репрезентативных геномах из каждой группы сортов риса, мы сравнили результаты нашего филогеномного анализа с популяционными геномными моделями в расширенном наборе сортов риса из разных сортов риса. группы.Мы получили данные геномного повторного секвенирования с высоким охватом (> 14 ×) (полученные с помощью короткочитываемого секвенирования Illumina) от сортов ландраса в рамках проекта «3K Rice Genome Project» [7] и из ландрасов циркум-басмати, которые мы повторно секвенировали. В общей сложности мы проанализировали 24 циркум-аусовых, 18 циркум-басматских и 37 тропических староместных сортов японской (см. Дополнительный файл 2: Таблица S16 для названий разновидностей). Необработанные показания секвенирования Illumina были сопоставлены с каркасным геномом Basmati 334 и генотипированы с помощью вычислений. Всего было выявлено 4 594 290 полиморфных сайтов по трем группам сортов риса и использовано для дальнейшего анализа.

Чтобы количественно оценить взаимосвязь между циркум-байтом, циркум-басмати и японской, мы провели анализ с взвешиванием топологии [95]. Для трех популяций существует три возможных топологии, и мы провели локализованный анализ скользящего окна, чтобы количественно определить количество уникальных поддеревьев, поддерживающих каждую топологию дерева. В соответствии с результатами филогеномного анализа, вес топологии был самым большим для топологии, которая сгруппировала японские и циркум-басмати как сестры (рис. 6a; вес топологии = 0.481 с 95% доверительным интервалом [0,479–0,483]). Топология, сгруппировавшая циркум-аус и циркум-басмати вместе как сестры, весила значительно больше (вес топологии = 0,318 с 95% доверительным интервалом [0,316–0,320]), чем топология, которая группировала японские и циркум-басмати как сестры (вес топологии = 0,201 с 95% доверительным интервалом [0,199–0,203]). Это согласуется с результатами сравнительного филогеномного анализа, который обнаружил признаки потока генов между циркум-байтом и цирку-басмати.

Взаимоотношения между популяциями риса с циркум-аусом (CA), циркум-басмати (cB) и японского риса (J). a Сумма весов топологии всего генома для трехпопуляционной топологии, включающей трио риса с циркум-байтом, циркум-басмати и японской. Веса топологии оценивались по окнам со 100 SNP. b Хромосомные распределения весов топологии, включающие трио риса по кругу, басмати и японскую (слева) и сумму весов топологии (справа). c Лучше всего подходит модель δaδi для риса с окр. Аусом, окр. Басмати и японской. См. Дополнительный файл 2: Таблица S17 для оценок параметров

Анализ смешения деревьев был проведен для трех популяций одомашненного риса (циркум-аус, циркум-басмати и японская) вместе с диким рисом O. rufipogon и O. barthii (Дополнительный файл 1: Рисунок S7). Мы подогнали к модели от нуля до трех краев миграции, и на трех краях миграции логарифмическая вероятность модели начала выходить на плато (дополнительный файл 1: рисунок S7B).На трех границах миграции граница миграции была подогнана между циркум-байтом и циркум-басмати (дополнительный файл 1: рисунок S7A), что соответствует нашим предыдущим результатам. Кроме того, между диким рисом O. rufipogon и циркум-басмати и между диким рисом O. barthii и японским были подогнаны края миграции. В целом, эти результаты миграции согласуются с недавними исследованиями, которые документально подтвердили наличие смешения между популяциями дикого и одомашненного риса [74, 90, 91].

Затем мы исследовали веса топологии для каждой отдельной хромосомы, так как тесты ABBA-BABA с использованием геномных сборок выявили вариации в родословной по окружности между разными хромосомами (рис. 5e). Результаты показали, что для большинства хромосом топология [(японская, циркум-басмати), циркум-аус] всегда весила больше, чем две оставшиеся топологии. Исключение наблюдалось для хромосомы 10, где вес топологии группировки циркум-аус и цирку-басмати как сестер был значительно выше (вес топологии = 0.433 с 95% доверительным интервалом [0,424–0,442]), чем вес для топологии всего генома, сгруппировавшей японские и циркум-басмати как сестры (вес топологии = 0,320 с доверительным интервалом 95% [0,312–0,328]). Это изменение преобладающей топологии все еще наблюдалось при вычислении весов для более широких локальных окон (дополнительный файл 1: рисунок S8). Другое исключение можно было увидеть для хромосомы 6, где топология всего генома [(japonica, circ-basmati), circ-aus] (вес топологии = 0.367 с 95% доверительным интервалом [0,359–0,374]) и топология примеси [(циркум-аус, циркум-басмати), япония] (вес топологии = 0,355 с 95% -ным доверительным интервалом [0,349-0,362]) имели почти равные веса. В окнах большего размера вес смешанной топологии был немного выше, чем вес полногеномной топологии (дополнительный файл 1: рисунок S8).

Чтобы оценить сценарий эволюции / одомашнивания, который мог бы объяснить наблюдаемые отношения между группами циркум-ауса, циркум-басмати и японской, мы использовали диффузионный подход программы δaδi [96] и подогнали конкретные демографические модели. к наблюдаемым частотным спектрам аллелей для трех групп сортов риса.Поскольку все три группы риса имеют признаки смешения друг с другом [7, 9, 14, 16], мы изучили 13 демографических сценариев, включающих симметричные, асимметричные модели и модели «без миграции» между группами сортов, с недавними изменениями численности популяции и без них ( Дополнительный файл 1: Рисунок S9). Чтобы свести к минимуму влияние генетической связи на демографическую оценку, полиморфные сайты были случайным образом обрезаны в окнах размером 200 кб, что привело к разделению 1918 сайтов. Наиболее подходящим демографическим сценарием был тот, который моделировал период разделения и изоляции клонов, в то время как поток генов происходил только после формирования трех популяций и в более позднее время (рис.6c; Визуализации двухмерного частотного спектра объекта и соответствия модели можно увидеть в Дополнительном файле 1: Рисунок S10). Эта наиболее подходящая модель была одной из моделей с меньшей параметризацией, которые мы тестировали, и разница в информационном критерии Акаике (ΔAIC) с моделью со вторым по величине правдоподобием составила 25,46 (см. Дополнительный файл 2: Таблица S17 для оценок параметров и максимального оценки правдоподобия для каждой демографической модели).

Генетическая структура в группе циркум-басмати

Мы использовали геномные данные популяции циркум-басмати для 78 разновидностей, выровненных по каркасному геному басмати 334, и назвали полиморфные сайты, сегрегированные в этой группе разновидностей.После фильтрации в наборе данных циркум-басмати осталось в общей сложности 4 430 322 SNP, которые использовались для изучения генетических взаимоотношений популяций в рамках циркум-басмати.

Мы провели анализ главных компонентов (PCA), используя данные полиморфизма, и обозначили каждый сорт риса циркум-басмати цветом в соответствии с его страной происхождения (рис. 7a). В PCA было предложено разделить рис циркум-басмати на три основные группы с четкими географическими ассоциациями: (группа 1) группа, проживающая в основном в Бутане / Непале, (группа 2) группа, базирующаяся в Индии / Бангладеш / Мьянме, и (группа 3) группа, базирующаяся в Иране / Пакистане.Сорта риса, которые нельзя было сгруппировать, занимали неоднозначное место по основным компонентам, что позволяет предположить, что они могут представлять собой смешанные сорта риса.

Структура населения риса циркум-басмати. — график PCA для набора геномных данных популяции риса циркум-басмати с 78 сортами. Три генетические группы, обозначенные в этом исследовании, можно увидеть в цветных кружках с пунктирными линиями. b Доля участков происхождения для K = 2, 3, 4 и 5 для 78 разновидностей риса циркум-басмати.Цветовая кодировка из ( a ) указана над долей происхождения каждого образца. c Географическое распределение 78 разновидностей риса циркум-басмати с их групповым статусом, обозначенным цветом в соответствии с a . d Агрономические измерения для 78 сортов риса циркум-басмати, разделенных на три группы, обозначенные в данном исследовании. Две звездочки указывают значение p <0,01, а три звездочки указывают значение p <0,001

Чтобы лучше понять происхождение каждого сорта риса, мы использовали fastSTRUCTURE [97] и варьировали предполагаемую предковую популяцию ( K ). ) от 2 до 5 групп, чтобы можно было оценить родословную долю каждого сорта риса (рис.7б). При K = 2 было показано, что рисовые группы Индия / Бангладеш / Мьянма и Иран / Пакистан имеют различные предковые компоненты, в то время как группа Бутана / Непала была в значительной степени смесью двух других групп. При K = 3 статус группировки, обозначенный в PCA, в значительной степени соответствовал наследственным компонентам. При K = 4 большая часть риса из Индии / Бангладеш / Мьянмы имела один наследственный компонент, но рис из Ирана / Пакистана имел два наследственных компонента, которые были общими с несколькими старыми сортами Бутана / Непала.Кроме того, некоторые из культурных сортов из последней группы, по-видимому, образуют группу, смешанную с сортами Индия / Бангладеш / Мьянма. Фактически, когда филогенетическое дерево было реконструировано с использованием полиморфных участков, разновидности внутри групп Индия / Бангладеш / Мьянма и Иран / Пакистан образовали монофилетическую кладу друг с другом. С другой стороны, разновидности Бутана / Непала сформировали парафилетическую группу, в которой несколько сгруппировались с разновидностями Иран / Пакистан (Дополнительный файл 1: Рисунок S11).

Затем мы провели второй анализ fastSTRUCTURE на популяции циркум-басмати, на этот раз включая популяции японской и циркум-аусной популяций, варьируя K от 2 до 5 групп (дополнительный файл 1: Рисунок S12).С K = от 2 до 5, японские и околоземные группы всегда образовывали две отдельные генетические группы. При K = 5 три окружные — генетические группы басмати, которые были обозначены в первом анализе (рис. 7), все еще наблюдались в популяции циркум-басмати. В нижнем K мы видим, что разные генетические группы циркум-басмати имели разное количество японских или циркум-басматических предков. В частности, группа Ирана / Пакистана имела более околоземное происхождение, в то время как группа Индии / Бангладеш / Мьянма имела большее происхождение от японцев.Группа Бутана / Непала снова была предложена как смесь двух других генетических групп риса циркум-басмати.

Таким образом, рис циркум-басмати эволюционировал по географическому градиенту, по крайней мере, с тремя генетическими группами (рис. 7c). Они существовали как отдельные предковые группы, которые позже смешались, чтобы сформировать несколько других разновидностей циркум-басмати. В частности, рис группы 1 и группы 3, возможно, подвергся большей примеси, в то время как староместные сорта группы 2 оставались генетически более изолированными от других субпопуляций циркум-басмати.Мы также обнаружили различия в агрономических характеристиках, связанных с выбранными нами группами (рис. 7d). Отношение длины зерна к ширине, которое является высоко ценимым признаком для некоторых видов риса циркум-басмати [24], было значительно больше у сортов группы 3 Иран / Пакистан. Вес тысячи ядер, с другой стороны, был самым высоким для разновидностей группы 2 Индия / Бангладеш / Мьянма и был значительно выше, чем у несгруппированных разновидностей и разновидностей группы 1 Бутан / Непал.

Метод эволюционной трассировки определяет функционально важные основания и сайты, общие для семейств РНК.

Образец цитирования: Новиков И.Б., Уилкинс А.Д., Lichtarge O (2020) Метод эволюционной трассировки определяет функционально важные базы и сайты, общие для семейств РНК.PLoS Comput Biol 16 (3): e1007583. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583

Редактор: Francois Major, U Montreal, CANADA

Поступила: 7 ноября 2018 г .; Принята к печати: 27 ноября 2019 г .; Опубликовано: 24 марта 2020 г.

Авторские права: © 2020 Novikov et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Данные, использованные для вывода в этом исследовании, включают выравнивание РНК, свободно доступное в базе данных Rfam http://rfam.xfam.org, и кристаллические структуры из банка данных протеина, также доступного на http://www.rcsb.org /. Идентификаторы доступа для этих данных перечислены в таблице S1. Метод, используемый для анализа выравнивания, доступен для скачивания по адресу https: // github.com / LichtargeLab / RNA_ET_ms.

Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (nih.gov), включая грант номер GM066099, GM079656, DE025181, грант Национального научного фонда (nsf.gov) номер DBI1356569 и Агентство перспективных исследовательских проектов Министерства обороны. (darpa.mil), номер гранта N66001-15-C-4042. Все гранты были присуждены OL. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Функциональные некодирующие (fnc) РНК представляют собой широкий класс функциональных макромолекул, которые регулируют транскрипцию и трансляцию, поддерживают стабильность генома [1] и играют роль в заболеваниях. Они встречаются в процессе эволюции и включают как классические, так и несколько новых форм, открытых за последние 30 лет. Хорошо известные классические РНК в первую очередь касаются трансляции: это рибосомная (r) РНК, транспортная (t) РНК, малая ядрышковая (sno) РНК и фермент созревания тРНК РНКаза P.Новые классы РНК включают самосплайсирующие рибозимы, которые контролируют репликацию вирусов, рибопереключатели, регулирующие метаболизм малых молекул в бактериях, малые регуляторные РНК (микроРНК), которые регулируют трансляцию мРНК у эукариот, и совсем недавно длинные некодирующие (lnc) РНК, которые влияют на пре- и посттранскрипционную экспрессию генов [2]. Таким образом, функциональные некодирующие РНК разнообразны и вносят значительный вклад в метаболизм клеток. Важно отметить, что фнкРНК связаны с болезнями человека. Например, мутации в митохондриальной РНКазе P связаны с гипоплазией хрящей и волос [3], делеция промотора, который управляет экспрессией snoRNA HBII-85, способствует развитию синдрома Прадера-Вилли [4], а также мутации в hTR, компоненте РНК теломеразы ДНК. , способствуют врожденному дискератозу [5].Более того, малые регуляторные РНК нарушаются при раке, сердечно-сосудистых заболеваниях и нейродегенеративных расстройствах [6], и исследования показали, что экспрессия фнкРНК значительно нарушена в линиях раковых клеток [7]. Длинная некодирующая РНК MALAT1 напрямую связана с метастазированием рака легких и желудка [8, 9]. Эти и другие fncRNA представляют собой совершенно новый класс мишеней, поддающихся лечению. Действительно, уже разработан ряд ингибиторов для нацеливания на патогенные fncRNA, включая рибопереключатели [10] и рибосомы [11].Учитывая растущее признание роли fncRNA в здоровье человека [12], важно понимать детерминанты функции этих молекул.

Чтобы понять структуру и функцию фнкРНК и нацелить их на терапию, главный вопрос заключается в том, какие нуклеотиды в данной молекуле вносят вклад в функцию? До сих пор ответы основывались на определении структуры и целенаправленном мутагенезе. Во-первых, вторичные или третичные структуры РНК решаются с помощью любого количества методов влажной лаборатории, таких как рентгеновская кристаллография, ЯМР, ферментативное или химическое зондирование [13], или с помощью алгоритмов in silico [14–18].На основе структурной модели конкретные нуклеотиды затем могут быть нацелены на мутагенез, как в [19]. Эта классическая экспериментальная парадигма требует значительных ресурсов и зависит от подходящих биохимических анализов, клеточных линий и жизнеспособных мутантов.

В исследованиях белков аналогичная проблема идентификации функционально важных аминокислотных остатков была эффективно решена с помощью методов прогнозирования, в первую очередь Evolutionary Trace, который является единственным наиболее подтвержденным подходом [20].Однако в исследованиях РНК в настоящее время нет хорошо проверенных вычислительных альтернатив экспериментальной парадигме (одним исключением является ориентированный на белок веб-инструмент ConSurf, который недавно добавил возможность оценивать сохранение последовательностей нуклеиновых кислот [21]). Поскольку эта область только зарождается, большинство инструментов анализа последовательностей РНК, таких как GERP ++ и PhastCons [22, 23], используются в основном в геномном контексте для идентификации новых экзонов или нкРНК, и на практике они не применимы к однонуклеотидным функциональным группам. анализ отдельных молекул РНК.

Кроме того, традиционной целью анализа последовательностей в РНК было моделирование вторичной и третичной структуры посредством обнаружения канонических пар оснований Уотсона-Крика. Первые исследования ко-вариации гомологов привели к вторичным структурам тРНК [24], 5S рРНК [25] и автокаталитических интронов [26]. Предсказание структуры с помощью анализа последовательности РНК дальше развивалось с помощью контекстно-свободных грамматических алгоритмов [27], а недавние достижения в этой области связаны с предсказанием неканонических дальнодействующих третичных контактов в более крупных молекулах [28].В отличие от ET, эти методы в первую очередь нацелены на предсказание структуры и не дают прямого анализа эволюционного значения на однонуклеотидном уровне.

Чтобы удовлетворить эту потребность, мы стремились адаптировать Evolutionary Trace [29, 30] для предсказания функциональных нуклеотидов в РНК на основе их эволюционной истории. Evolutionary Trace — это метод определения функционально важных остатков в белках. Он коррелирует вариации последовательностей с эволюционными расхождениями, чтобы ранжировать позиции последовательностей как более (или менее) важные для функционирования (рис. 1).Поступая таким образом, ET делает два предположения. Во-первых, вариации последовательности во время эволюции и видообразования сродни выборке пространства последовательностей-функций посредством влажных лабораторных мутаций. Во-вторых, глубина расхождения между двумя последовательностями соизмерима с их функциональным различием, то есть эта глубина является количественной оценкой функционального расстояния. Если это так, систематический подсчет вариаций в любом заданном положении множественного выравнивания последовательностей, которые отслеживаются в основном с глубокой (или небольшой) филогенетической дивергенцией, позволит ET присвоить каждой последовательности больший (или меньший) относительный ранг эволюционной важности. позиция.Совсем недавно было признано, что такое систематическое соединение вариаций в пространстве последовательностей (генотип) с вариациями в эволюции (пространство пригодности) может быть формально преобразовано в градиент эволюционного отображения генотипов на ландшафт приспособленности [31] . Рассмотрение ET как градиента эволюционного ландшафта, предположительно основополагающей особенности биологии, помогает объяснить, что относительно простой процесс in silico отслеживания филогенетических деревьев и выравнивания гомологичных последовательностей (см. Методы) приводит к разнообразному и полезному пониманию молекулярных структур. основа функции белка.Нацеливая мутации на верхние позиции последовательности (так называемые остатки ЕТ), исследования под руководством ЕТ идентифицируют интерфейсы белок-белок [32–34], аллостерические [35] и сайты связывания лиганда [36], перекодируют специфичность лиганда [35 ], сконструировал функционально-активные пептиды [37] и в структурном протеомном масштабе расчетно предсказал функцию орфанных белков [38, 39].

Рис. 1. Модель эволюционного следа.

Для набора гомологов ET количественно определяет корреляцию между дивергенцией филогенетического дерева и вариацией последовательностей.Нуклеотиды ET, где корреляция наиболее высока, считаются эволюционно и функционально важными. Они группируются по структуре и предсказывают функциональные сайты. Кроме того, качество структурной кластеризации нуклеотидов ET может быть измерено, а затем оптимизировано для улучшения предсказания функционального сайта.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g001

Возникает естественный вопрос, можно ли получить аналогичное представление о РНК, преобразовав формализм ЕТ с аминокислотных последовательностей в нуклеотидные последовательности.Это легко проверить, поскольку в белках верхние ранжированные остатки ET обладают хорошо установленными общими свойствами, лежащими в основе успеха метода: (1) ET может ранжировать положения аминокислотных последовательностей от наиболее до наименее важных, так что те, которые находятся в верхних 30 ^{-м процентиле} , являются называется остатками ET. (2) Эти остатки ЕТ кластеры в трехмерной структуре молекулы [40] и (3) перекрывают ее функциональные сайты [32]. (4) Важно то, что качество структурной кластеризации остатков ET влияет на качество перекрытия функциональных сайтов [41].И, наконец, (5) качество перекрытия может быть улучшено с помощью оптимизированного выбора последовательностей, который максимизирует кластеризацию ET [42] и минимизирует различия рангов соседних остатков (структурное сглаживание рангов ET) [43].

Таким образом, чтобы обобщить использование ET для последовательностей РНК, мы попытались проверить, проявляют ли нуклеотиды ET эти пять свойств. Мы применили наши тесты к репрезентативному набору молекул РНК из базы данных Rfam [44] (рис. 2A) и обнаружили, что основания ET подчиняются тем же общим правилам, что и остатки ET.В частности, мы сосредоточились на подмножестве хорошо охарактеризованных РНК с известными третичными структурами (рис. 2В), которые составляют 7% нашего тестового набора и также достаточно репрезентативны для общей биологии РНК. На практике данные показывают, что Evolutionary Trace может быть легко применен к множественному выравниванию последовательностей гомологичных фнкРНК для идентификации нуклеотидов, имеющих функциональное значение.

Рис. 2. Набор тестов Rfam представляет широкий выбор функциональных РНК.

На рисунке (A) показаны семейства Rfam, которые мы использовали в нашем тестовом наборе.В (B) — это подмножество тестовых семейств Rfam, которые сопоставляются со структурами высокого разрешения в банке данных белков (PDB), что позволяет нам изучать трехмерную кластеризацию по нуклеотидам ET.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g002

Методы

Измерение важности нуклеотидов с помощью реального значения ET

Для измерения важности нуклеотидов мы используем эволюционный след (рис. 1). Первым шагом в анализе ET является создание репрезентативного выравнивания множественных последовательностей (MSA) для запрашиваемой последовательности и ее гомологов.Здесь мы используем вручную подобранные выравнивания семян из базы данных Rfam [44], каждое из которых имеет не менее 10 канонических последовательностей. Выравнивание используется для построения филогенетического дерева UPGMA, после чего оба этих дерева отслеживаются. ET выполняет итерацию по столбцам последовательностей и присваивает ранг в зависимости от того, насколько близко вариация последовательности в столбце коррелирует с ветвлением дерева (обратите внимание, что пробелы рассматриваются как нуклеотид). Алгоритм ET первого поколения [29, 32] выражает ранг как: (1) где r _i — это ранг остатка в позиции i , N — общее количество последовательностей в дереве, а N -1 — количество узлов.Чтобы вычислить r _i , мы перебираем каждый узел n , начиная с одного, ближайшего к корню (n = 1), и разделяем последовательности в выравнивании на подгруппы g на основе топологии дерево. Поскольку дерево является двоичным, на уровне узла n дерево делится на группы g = n . Это разделение дерева на подгруппы показано на рис. S1. Мы присваиваем от 0 до δ (n) , если остаток в позиции i инвариантен внутри всех групп последовательностей g, и 1 в противном случае.Таким образом, эволюционно важные нуклеотиды, которые закреплены в основных ветвях, получат более низкий абсолютный ранг r _i , чем остатки, которые продолжают изменяться при обходе дерева.

Чтобы проиллюстрировать последний пункт, рассмотрим два крайних примера. Во-первых, столбец последовательности, который полностью сохранен, получит ранг ET r = 1. Поскольку столбец сохраняется, δ ( n ) равно 0 на каждом шаге n в функции суммирования в уравнении (1). .Соответственно, окончательная сумма равна 0, а рейтинг ET столбца равен 1, наименьший абсолютный рейтинг ET (соответствующий наивысшему уровню эволюционной важности). Напротив, рассмотрим столбец, который продолжает изменяться, пока не будет разделен на N-1 подгруппу (по сути, каждая последовательность находится в своей собственной подгруппе). Для такого столбца на каждом шаге n , δ ( n ) = 1, а конечный ранг r = N , самый низкий возможный ранг для выравнивания последовательностей N .

Этот подход дает целочисленные ранги и страдает от того, что каждый узел рассматривается как одинаково важный, что не всегда верно. Чтобы решить эту проблему, мы разработали ET (rvET) [20, 30], расширяющий базовый метод, который использует информационную энтропию для взвешивания филогенетических ветвей в соответствии с сохранением их последовательности: (2) где — частота встречаемости амино (или нуклеиновой) кислоты a в группе последовательностей g , которая принадлежит узлу n . Теперь, когда мы пересекаем дерево, мы суммируем, а затем усредняем информационную энтропию для каждого из суб-выравниваний g , наблюдаемых при разбиении дерева на n узлов.Это позволяет нам получать более разрешенные ранги r _i , которые более устойчивы к несоответствиям последовательностей, при этом учитывая филогенетическую историю дерева.

Из двух описанных здесь реализаций ET мы используем в своей работе более продвинутую ET с реальным значением (rv). Применяя rvET к выравниванию гомологов РНК, мы приходим к относительному ранжированию эволюционной важности для каждой позиции в выравнивании. На практике мы нормализуем ранги до процентильных рангов или охвата.Охват 5% включает верхние 5% нуклеотидов с самым высоким рейтингом и так далее. Условно мы называем нуклеотиды, ранжируемые между 0% и 35% отсечения ранга ET (охват 35% ET), как нуклеотидов ET . Выбор 35% продиктован нашим предыдущим опытом работы с белками, где остатки белка, ранжированные примерно между 20–30% покрытия ранга ET, соответствуют наиболее важным функциональным сайтам белка.

Измерение кластеризации и перекрытия нуклеотидов

Чтобы измерить структурную кластеризацию по нуклеотидам ET, мы разработали концепцию Selection Clustering Weight (SCW), подробно описанную в [45].Вкратце, для набора нуклеотидов S , Selection Clustering Weight, w , представляет собой количество структурных контактов, образованных членами S . Для вычисления w представим структуру в виде матрицы смежности A : (3) где d — расстояние между любыми двумя нуклеотидами i и j , а контакт обозначается как A (i , j) = 1 , если d составляет 4Å или меньше. Используя функцию выбора S (x) (которая возвращает 0, если нуклеотид x не найден в S , и 1 в противном случае), мы перебираем A и вычисляем w : (4)

Чтобы оценить статистическую значимость w , мы сравниваем его со средним ожидаемым весом кластеризации 〈 w 〉 по случайному набору нуклеотидов того же размера, что и S .Мы выражаем разницу между весом кластеризации набора нуклеотидов S и случайными нуклеотидами в виде z-показателя кластеризации z _c : (5) где σ — стандартное отклонение 〈 w 〉. Как 〈 w 〉, так и σ можно рассчитать аналитически, как описано в [39]. Используя эту процедуру, мы рассчитали статистическую значимость кластеризации по нуклеотидам ET.

Подобно кластеризации z-показателя, мы вводим z-показатель перекрытия z _o , чтобы оценить, насколько хорошо нуклеотиды ET предсказывают функционально значимые сайты.Учитывая заранее определенный набор функциональных нуклеотидов размером M и набор нуклеотидов ET размером n в молекуле длиной N , мы можем использовать гипергеометрическое распределение для расчета среднего ожидаемого перекрытия между ними: (6) где m — количество функциональных нуклеотидов, которое можно было бы ожидать при выборе размера n, если бы выбор был случайным. Стандартное отклонение м определяется по формуле: (7)

Если фактическое наблюдаемое количество функциональных нуклеотидов в выбранном наборе составляет k , мы можем вычислить z-оценку перекрытия z _o как: (8)

Наконец, на практике мы вычисляем как кластеризацию, так и перекрывающиеся z-баллы по всему диапазону рангов ET.Мы кумулятивно объединяем нуклеотиды в соответствии с их рангом ET, так что выбор S соответствует всем нуклеотидам с определенным порогом ранга ET (охват ET), а затем измеряем z-баллы в каждом интервале. Поскольку нас интересуют нуклеотиды с наивысшим рейтингом, мы усредняем z-баллы в ячейках от 0 до 35% перцентиля ранга (от 0 до 35% покрытия ET), чтобы получить единичный показатель, Также обратите внимание, что максимально возможное количество уникальных рангов и интервалов рангов составляет L , длина последовательности запроса.Однако несколько нуклеотидов могут иметь один и тот же ранг, в результате чего ряд уникальных ранговых ячеек остается пустым (не присваиваемым никаким нуклеотидам). Мы по-прежнему включаем эти интервалы в совокупный показатель, неявно присваивая им z-оценку из ближайшего действительного интервала.

Измерение гладкости ET

Помимо количественной оценки кластеризации ET как z-показателя кластеризации, мы также определили глобальную меру кластеризации, которую мы называем гладкостью ET , SMT . SMT отражает, насколько плавно ранги ET распределяются по структуре путем подсчета разницы рангов соседних нуклеотидов: (9) где A — матрица смежности, как описано ранее, а x — ранг ET нуклеотидов.В исходной работе, посвященной гладкости [43], мы установили, что эволюция имеет тенденцию минимизировать разницу в эволюционной важности между соседними остатками, потому что остатки оказывают селективное давление друг на друга.

Набор для испытаний Rfam

Мы проследили выравнивание семян 1070 семейств из базы данных Rfam, каждое семейство содержало минимум 10 уникальных канонических последовательностей (рис. 2А). Из них 71 семейство с доступными структурами высокого разрешения составило структурированный тестовый набор, который мы протестировали для трехмерной кластеризации ET (рис. 2B).Кроме того, для набора из 15 семейств мы составили «золотой стандарт» для проверки перекрытия с нуклеотидами ET. Эти наборы тестов Rfam перечислены в таблице S1. Кроме того, рибосомный «золотой стандарт» указан сам по себе в таблице S2.

Результаты и обсуждение

Пример # 1: рибозим Hammerhead

Первым тестом на ET был рибозим «головка молотка», цис-расщепляющая структура, наиболее часто встречающаяся в растительных вирусах, которая участвует в репликации катящегося круга, расщепляя зарождающийся транскрипт [46, 47].Мотив «головка молотка» не ограничивается вирусами, и новые члены этого семейства были недавно описаны у бактерий и эукариот [46], где они могут поддерживать процессинг тРНК и миРНК, ремоделирование ORF и ингибирование РНКи. Полноразмерная последовательность головки молотка составляет 60 нуклеотидов, а структура определяется тремя короткими спиралями, которые встречаются в месте соединения (Рис. 3A, PDBID 2QUS [48]). Есть два основных функциональных домена, каталитическое ядро, которое охватывает трехстороннее соединение и отвечает за расщепление, и дистальная область, определяемая взаимодействиями тетрапетли стебля I-стебель II, которые способствуют эффективному складыванию [49].Нуклеотиды, составляющие эти два домена, обозначены на фиг. 3A. Эволюционный след был вычислен на 26 неизбыточных выровненных последовательностях рибозимов типа «голова молота» класса I и класса II, которые представляли основные ветви вирусов растений. Это привело к нормализованному ранжированию ET каждой базовой позиции от 0% (наиболее важная для эволюции) до 100% (наименее важная), которые были нанесены на структуру на рис. 3A. Это отображение выделяет два кластера оснований ET, определяемых процентилем ранга ET ниже 35% (в дальнейшем называемых основаниями ET или нуклеотидами ET).Первый из этих кластеров состоит из 12 нуклеотидов ЕТ и перекрывает каталитический переход. Второй кластер состоит из 5 нуклеотидов ET и перекрывает дистальную область тетрапетли. Функциональные нуклеотиды и их соответствующие домены перечислены на фиг. 3A.

Рис. 3. Кластер нуклеотидов ET и предсказание функциональных сайтов в рибозиме «головка молотка».

(A) Ранги ET, картированные в структуре «головки молотка», выявляют кластеры нуклеотидов ET, которые перекрывают канонические функциональные сайты (меченые нуклеотиды).(B) Кластеризация нуклеотидов ET статистически значима. (C) Z-оценка перекрытия ET подтверждает, что нуклеотиды ET информируют оба канонических функциональных сайта. (Для расчета конкретных сайтов мы исключаем другие известные сайты из рассмотрения).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g003

Поскольку кластеризация по остаткам ET является определяющей особенностью аминокислотной ET, мы оцениваем кластеризацию нуклеотидов ET в головке молота. Вкратце, чтобы количественно оценить кластеризацию нуклеотидов ET, мы вычисляем количество попарных структурных контактов (расстояние 4Å или меньше) между нуклеотидами ET, w , и сравниваем его с количеством контактов, образованных таким же количеством нуклеотидов, выбранных случайным образом, 〈 w 〉.Затем, используя стандартное отклонение, связанное со случайным отбором, σ, мы выражаем значимость кластеризации по нуклеотидам ET как z-оценку. наблюдаемое количество базовых контактов ET из числа контактов, ожидаемых случайным образом, а z-значения 2 и выше обозначают статистическую значимость. См. Подробности в разделе «Методы».

Используя эту метрику, мы рассчитали кластеризацию нуклеотидов в форме головки молотка, объединенную кумулятивно в соответствии с их рангом ET.Мы рассчитали z _c для каждого бина от 0 до 35% покрытия ET (ранговый процентиль) и обнаружили, что нуклеотиды ET кластерируются со средним z-значением (рис. 3B). Неудивительно, что профиль кластеризации на рис. 3B подобен поведению остатков ET в белках, наблюдаемых в нашей предыдущей работе [41]. Мы наблюдали высокий начальный z-показатель, свидетельствующий о кластеризации оснований ET с гипотетическим образованием основного функционального сайта, за которым следует снижение по мере того, как мы расширяем охват ET, чтобы включить нуклеотиды с более низким рангом.Эти данные подтверждают кластеризацию нуклеотидов ET в структуре, чего мы не ожидали бы, если бы выбор нуклеотидов был случайным.

Затем мы оценили второе основное свойство ET: перекрытие между нуклеотидами ET и функциональными сайтами молекулы. Чтобы измерить статистическую значимость перекрытия в головке молота, мы подсчитали количество баз активных сайтов в каждом бункере ET, k , и сравнили это с количеством баз активных сайтов, которое ожидается восстановить при случайном выборе, m .Случайный выбор был смоделирован как гипергеометрическое распределение и имел соответствующее стандартное отклонение, которое позволило нам преобразовать k в z-оценку перекрытия z _o (подробности см. В разделе «Методы»).

Мы рассчитали z-показатель перекрытия для головки молота как функцию от покрытия ET, и он показан на рис. 3C, а основные данные представлены в таблице S3. Первая точка на кривой (z _o = 3,6 при 23% -ном покрытии ЕТ) соответствует перекрытию ЕТ с каталитическим ядром молекулы.За этим следуют два сильных всплеска, первый из которых соответствует восстановлению наиболее важных нуклеотидов во втором функциональном сайте (z _o = 4,5 при покрытии ET 32%), а затем восстановлению оставшихся нуклеотидов в каталитическом ядре (z _o = 4,6 при 41% покрытии ET). После этого каждый дополнительный спайк соответствует восстановлению функционального нуклеотида по более низкому порогу ЕТ. Эти данные показывают, что нуклеотиды ET (диапазон 0–35%) сильно перекрывают два активных сайта головки молотка (средний z-показатель).В дополнение к z-баллу перекрытия, мы также измерили качество прогноза ET более традиционным способом, используя кривые характеристики приемник-оператор (ROC), и ранжирование ET восстанавливает активные сайты в форме головки молотка с AUC = 0,82 (S2A, рис.).

Далее мы исследовали кластеры ET более подробно. Основной 12-нуклеотидный кластер ET перекрывает 16-нуклеотидный каталитический сайт в «головке молотка» [19] со средним z-значением для сайта и AUC 0,87 (центр рис. 3B и S2B , рис. ). Примечательно, что кластер ЕТ содержит ключевые каталитические нуклеотиды G12 и G8 (оба с процентилем ранга ЕТ 23%), которые являются основным основанием и кислотой в реакции расщепления.Кластер ET также обогащен термодинамически дорогостоящими неспаренными нуклеотидами (A6, G5, U4) и нуклеотидами, спаренными неканоническим образом Хугстена (C3 образует пару Хугстена с U7 и G8, C17 с A13 и U16.1). Базы с высоким рейтингом, по-видимому, выполняют критическую функциональную роль, сохраняемую в процессе эволюции, что приводит к их высшим рейтингам ET. Важно отметить, что мутации в 11 из 12 нуклеотидов в этом кластере ET полностью устраняют активность расщепления [19]. Эти данные подтверждают, что кластер ET напрямую перекрывает основной функциональный сайт головки молотка.

Следует отметить, что четыре основания в каталитическом ядре (U16.1, C17, U7 и G1.1) не являются частью 12-нуклеотидного кластера ET, поскольку их рейтинг ET составляет 36%, 52%, 77% и 96% попадают ниже порога 35%, который мы использовали для определения кластера ET. В то время как U16.1 преодолевает порог в 35% и на практике будет считаться частью кластера ET, три другие базы требуют более тщательного изучения. Их значительно более низкие ранги предполагают, что эти позиции могут находиться под меньшим функциональным давлением или, возможно, что существует внутренняя функциональная устойчивость к мутациям.Чтобы проверить эту гипотезу, мы тщательно исследовали каталитический механизм «головки молотка» и функциональную роль этих трех нуклеотидов.

Хотя два нуклеотида G1.1 и C17 (процентиль ранга ET = 96% и 52%) непосредственно участвуют в реакции (C17 является нуклеофилом, и его активированная 2′-гидроксильная группа атакует фосфатную группу сидячей G1.1 [48 ]), критический путь переноса электронов проходит вдоль сахарно-фосфатного остова, а не их азотистого основания. В результате ни один G1.1, ни нуклеотид C17 не находится под сильным селективным давлением. Действительно, прямые мутационные исследования показали, что позиция 1.1 вмещает все четыре основания, а C17 также может вмещать гуанин и аденин (снижение активности на 20% [19]). Тем не менее, C17 образует неканоническую пару Hoogsten с коровым нуклеотидом A13 и, возможно, в результате не может аккомодировать урацил (снижение активности в 500 раз [19]). В соответствии с этим большим давлением отбора, C17 имеет значительно лучший рейтинг ET (52%), чем сидячий G1.1 (96%).

Другое заметное исключение в каталитическом ядре — U7 (процентиль ранга ET = 77%). Это основание вложено среди 12 нуклеотидов ET, что несовместимо с его очевидной мутационной свободой. Тем не менее, исчерпывающие исследования мутагенеза подтвердили, что U7 допускает замену [19]. В то время как замена любого из 12 нуклеотидов ЕТ в каталитическом ядре снижает активность от 10 до 1000 раз, мутации U7 не влияют на скорость реакции. Таким образом, базовая идентичность U7 не является структурно или функционально критичной в соответствии с более низким рангом ET.

В отличие от этих данных, есть свидетельства того, что последнее исключение, U16.1, которое перекрывает порог ET (рейтинг ET = 36%), является критически функциональным. Это основание расположено близко к ядерным нуклеотидам G12 и C17 (общее основание и нуклеофил в реакции расщепления), и недавнее исследование показало, что U16.1 может быть ответственным за координацию Mg ²⁺ в связывающем кармане, образованном тремя основаниями. [50]. Предполагаемая роль иона — снизить p K _a G12, чтобы сделать его более реактивным по отношению к C17.Следовательно, в отличие от трех исключений с низким рейтингом, U16.1, вероятно, является функциональным, о чем свидетельствует его ранг, близкий к пороговому. Вместе эти данные показывают, что ранги ET основных каталитических нуклеотидов замечательно согласуются с мутационной и биохимической интерпретацией их функциональной роли.

Затем мы исследовали апикальный кластер, образованный пятью нуклеотидами ЕТ (U19, G20, G22, U44 и A46) в петлях стебля I и II. Этот кластер ET перекрывает домен tetraloop-tetraloop из 11 оснований головки молотка (обозначенный как Distal region на фиг. 3A), который важен для эффективного сворачивания ядра головки молотка [49].Внутри домена нуклеотиды ET образуют структурно критические связи между двумя стволами: U19 стержня I образует пару с A46 стержня II, тогда как G20 и G22 связываются с G45. Примечательно, что эти взаимодействия являются энергетически неблагоприятными парами Уотсона-Крика / Хугстина, что предполагает, что голова-молот поддерживает их в процессе эволюции, потому что они функциональны. Последний нуклеотид ET в этом кластере, U44, не образует межстебельных взаимодействий, предполагая, что он выполняет иную структурную роль. Из оставшихся шести (не-ET) оснований в домене только два образуют неканонические взаимодействия, и одно из них (U21) имеет рейтинг чуть ниже порога ET (процентиль ранга ET = 39%).Эти данные показывают, что ET различает более и менее важные нуклеотиды в этом домене. В целом, основания ET перекрываются с дистальным доменом со средней z-оценкой, и ET предсказывает этот домен с AUC 0,76 (рис. 3C справа и S2C рис).

Примечательно, что две группы ET соответствуют принятой двухступенчатой ​​модели складывания головки молотка. В этой модели ствол I и II дистальной области складываются первыми, тем самым способствуя эффективному складыванию каталитического ядра [51]. Каталитическое ядро ​​универсально консервативно, и действительно, ET действует очень похоже на сохранение последовательности при его идентификации, как показано на фиг. S3A (z-оценка перекрытия) и S3B фиг. (ROC-кривая).

Однако в дистальной области отсутствует очевидная консервация последовательности. В результате его открытие было отложено на несколько лет, поскольку исследователи сосредоточились исключительно на консервативном каталитическом ядре. В конце концов, кинетические и химерные исследования на полноразмерной части головки молотка [49, 51] показали, что тетрапетля является функционально важным доменом. Ранжирование баз в соответствии с консервативностью последовательностей не позволяет выявить тетрапетлевой домен, а ET превосходит сохранение как по показателю z-показателя (рис. S3C, средний z-показатель перекрытия по сравнению с 0.41), и ROC AUC (S3D Fig, AUC = 0,76 против AUC = 0,63). ET обнаруживает дистальные тетрапетли, потому что, хотя они довольно изменчивы по всему дереву, они сохраняются в пределах своих соответствующих ветвей класса I и класса II. ET обнаруживает этот образец базовой вариации, что приводит к большей предсказательной способности. Ранжирование на основе сохранения, отображаемое на структуру на S4 Fig, подчеркивает эту разницу между ET и сохранением последовательности.

Итак, эти данные показывают, что ET обнаруживает кластеры эволюционно важных оснований, которые определяют функциональные домены головки молотка.Экваториальный кластер ET перекрывает каталитическое ядро ​​головки молотка, а апикальный кластер ET перекрывает наиболее важные основания в тетрапетлевом домене. Примечательно, что ET превосходит консервацию при подсчете оснований в тетрапетлевом домене, потому что он принимает во внимание эволюционную историю молекулы. Кроме того, если биохимические данные доступны для отдельных нуклеотидов, они удивительно согласуются с рангами нуклеотидов, присвоенными ET.

Пример # 2: Бактериальная рибосома

Второй модельной системой РНК для тестирования ET была бактериальная рибосома.Рибосома — это универсально консервативный рибонуклеиновый комплекс, который синтезирует полипептиды из матриц мРНК. Зрелые бактериальные рибосомы состоят из двух молекул РНК, рибосомной (р) РНК 16S и 23S, а также более 50 рибосомных белков, которые связывают рРНК во время сборки. Первоначально считалось, что РНК-компонент рибосомы играет в первую очередь структурную роль, но кристаллические структуры с высоким разрешением показали, что рРНК, по сути, ответственны за каталитическую активность рибосомы.16S рРНК декодирует сообщение мРНК путем избирательного связывания ацилированных тРНК [52], в то время как 23S рРНК катализирует образование пептидной связи [53] (Рис. 4A, PDBs 2WDK и 2WDL [54]). Неудивительно, что рибосома является важной мишенью для лекарств, на сегодняшний день разработано более 50 бактериальных антибиотиков [10].

Рис. 4. ET-картирование выявляет кластеры, которые перекрывают активные сайты в рибосоме.

ранги ET отображаются на структуру в (A). Обратите внимание на непрерывный кластер ET, который охватывает обе субъединицы и содержит центр пептидилтрансферазы (PTC) и центр декодирования.Оба подробно показаны на (B) и (C), где помечены известные каталитические нуклеотиды.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g004

Следы для 16S и 23S РНК были вычислены с использованием курированных выравниваний бактериальной рРНК, предоставленных как часть [55]. Ранги ET, нанесенные на карту в трехмерной структуре РНК (рис. 4A), показали, что нуклеотиды ET сгруппированы в структуре (средний z-балл кластеризации ET в 16S и 32,8 в 23S, рис. 5). Более того, нуклеотиды ET широко перекрывают основные функциональные сайты в рибосоме — центр пептидил-трансферазы в 23S и центр декодирования в 16S (соответствующие нуклеотиды отмечены на рис. 4B и 4C).Количественная оценка перекрытия для этих и других основных функциональных сайтов обобщена на рисунке 6 (соответствующие кривые ROC см. На рисунке S5, в таблице S2 указаны нуклеотидные определения каждого активного сайта и в таблице S4 указано исходное количество функциональных нуклеотидов, восстановленных при пороге ET 35%. ). Более подробно, в 16S рРНК основания ET перекрывали центр декодирования (среднее значение AUC = 0,91), E-, A- и P-сайты тРНК (среднее значение AUC = 0,88), а также канал мРНК (среднее значение Z-показатель перекрытия ET, AUC = 0,98). В 23S рРНК кластер ЕТ перекрывает центр пептидилтрансферазы (среднее значение, AUC = 0.94), сайты связывания тРНК (среднее значение и AUC = 0,86), а также центр, связанный с GTPase (среднее значение, AUC = 0,72) и петля сарцин-рицин (среднее значение, AUC = 0,85). Эти данные показывают, что ET обнаруживает критически важные активные сайты в рибосоме.

Рис. 6. ET предсказывает функциональные сайты в рибосоме.

(A) Перекрытие между основаниями ET и функциональными сайтами в 16S РНК. Сайтами являются: центр декодирования (DC), сайты связывания тРНК, канал мРНК, сайты связывания фактора трансляции (TF), сайты контакта структурных белков, сайты связывания антибиотиков и модифицированные основания.(B) Перекрытие между основаниями ET и функциональными сайтами в 23S рРНК. Сайты представляют собой центр пептидилтрансферазы (PTC), сайты связывания тРНК, петлю сарцин-рицина (SRL), центр, связанный с GTPase (GAC), сайты связывания факторов трансляции, сайты контакта структурных белков, сайты связывания антибиотиков и модифицированные основания. Соответствующие ROC AUC показаны на фиг. S5. Нуклеотиды, определяющие каждый функциональный сайт, перечислены в таблице S2.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g006

Затем мы проверили, перекрывают ли основания ET также сайты связывания с белками (см. панели на рис. 6A и 6B).Во-первых, мы исследовали сайты связывания бактериальных факторов трансляции (включая IF1, EF-Tu, EF-G, RF1 и RF3, для которых доступны структуры с высоким разрешением). Они временно связываются с рибосомой и необходимы для своевременного инициирования, удлинения и прекращения трансляции. Мы определили сайты связывания как все основания рРНК в пределах 4 Å от белка и обнаружили, что основания ET перекрывают сайты связывания TF со средним значением ET z в 16S рРНК и 9,2 в 23S (AUC = 0,84 и 0,94 соответственно). Затем мы протестировали сайты связывания структурных рибосомных белков, которые служат каркасом и охватываются рРНК во время сборки [56].Основания ET перекрывают эти контактные сайты со средним z-баллом ET = 0,96 и 4,6 в 16S и 23S соответственно (AUC = 0,62 и 0,63). Как и ожидалось, перекрытие между основаниями ET и сайтами связывания факторов трансляции заметно выше, чем перекрытие ET со структурными сайтами контакта с белками. Это соответствует ожиданиям, что структурные белки не так важны для функционирования. Неожиданным является несоответствие между перекрытием ET для сайтов r-белков в 16S и 23S рРНК (0,96 против 4,6). Интересно, что r-белки в 16S занимают 42% всех нуклеотидов, по сравнению только с 29% в 23S рРНК.Это подразумевает более высокую специфичность связывания в субъединице 23S, что приводит к лучшему перекрытию с нуклеотидами ET. Эти данные отражают чувствительность инопланетян к эволюционному давлению, оказываемому на рибосому. ET четко отделяет более важные сайты, такие как каталитическое ядро ​​и сайты связывания TF, от сайтов r-белка. Таким образом, ранги нуклеотидов в ET сильно коррелируют с их функциональным воздействием.

Затем мы также протестировали критические структурные мостики [57], которые соединяют две субъединицы на перекрытие с нуклеотидами ET.Мы обнаружили, что основания ET перекрывают мостики в 23S (среднее значение и AUC = 0,82), но не в субъединице 16S (среднее значение, AUC = 0,66). Чтобы объяснить эту разницу, мы исследовали молекулярную основу мостиковых контактов и обнаружили, что 22 из 48 контактов на стороне 16S образованы нуклеотид-фосфатным остовом, по сравнению с 7 из 30 контактов на 23S (разница значительна. с гипергеометрическим значением p 0,03). Поскольку фосфатные контакты неспецифичны (не зависят от идентичности основания), нуклеотиды в мостиках 16S не ограничены эволюционным путем и имеют более низкий рейтинг по ET.Эти данные показывают, что хотя ET способен обнаруживать критические структурные элементы, лежащие в основе молекулярные детерминанты могут создавать исключения из модели ET, аналогично предыдущему примеру каталитического механизма в головке молота.

Поскольку основания ET широко перекрывают функциональные сайты, мы затем спросили: действительно ли известные рибосомные антибиотики нацелены на основания ET? Чтобы определить, восстанавливает ли ET известные сайты связывания антибиотиков, мы составили список сайтов связывания для 32 различных антибиотиков [11]. Мы количественно оценили восстановление этих сайтов с помощью ET и обнаружили, что основания ET перекрывают сайты связывания антибиотиков со средним z-значением ET в 23S и 4.3 в 16S (AUC = 0,62 и 0,80). Хотя данные подтверждают, что основания ET сильно перекрываются с сайтами связывания антибиотиков в 16S рРНК, мы спросили, почему отсутствует перекрытие в субъединице 23S. Мы исследовали молекулярные основы действия антибиотиков в 16S и 23S рРНК. Мы обнаружили, что антибиотики 23S в основном нацелены на выходной канал, который представляет собой туннель, пересекающий субъединицу, и он используется для вытеснения растущего полипептида из рибосомы. Поскольку канал не служит сайтом для катализа или связывания, он выстлан нуклеотидами, которые не находятся под сильным селективным давлением.В результате сайты связывания антибиотика 23S имеют небольшое перекрытие с основаниями ET. Напротив, мы обнаружили, что в 16S РНК семейства антибиотиков в первую очередь нацелены на канал связывания мРНК и центр декодирования, которые, как мы уже показали, в основном состоят из оснований ET высокого ранга. Таким образом, молекулярный механизм действия антибиотиков соответствует ранжированию нуклеотидов ET.

Затем мы протестировали способность ET обнаруживать основания, которые не обязательно принадлежат установленному активному сайту или интерфейсу связывания, но, тем не менее, предположительно важны: модифицированные основания и основания с известными вредными мутациями. Сначала мы исследовали модифицированные основания; возникающие рРНК могут быть посттранскрипционно модифицированы, и по крайней мере 34 нуклеотида в рибосоме несут модификации [58].Хотя точная роль модифицированных оснований неясна, рибосомы, собранные из немодифицированной рРНК, менее активны, чем дикого типа [59]. ET перекрывает модифицированные основания со средним значением ET z-score в 16S и 5,7 в 23S (AUC = 0,93 и 0,87), предполагая, что эти основания эволюционировали, чтобы выполнять функцию в большой субъединице. Помимо модифицированных оснований, мы исследовали нуклеотиды с известными вредными мутациями. Мы составили список мутаций, доступных в базе данных Comparative RNA Website [60], и отсортировали их на однозначно вредные и доброкачественные.Применяя ET, мы видим, что хотя обе когорты перекрываются с основаниями ET, существует четкое разделение между двумя категориями мутаций (S6 Fig). В 16S основания ET перекрываются с вредными мутациями чаще, чем с доброкачественными мутациями (средний z-показатель = 4,5 и AUC = 0,92 для вредных мутаций и AUC = 0,69 для доброкачественных). В субъединице 23S разница также присутствует (средний z-показатель и AUC = 0,94 для вредных мутаций и AUC = 0,81 для доброкачественных). Нуклеотиды с доброкачественными мутациями имеют более низкий рейтинг, чем нуклеотиды с летальными мутациями.Эти данные также указывают на четкую связь между эволюционной важностью, измеряемой ЭТ, и функциональным воздействием.

Наконец, мы исследовали кластеры ET, которые не перекрываются с известным функциональным сайтом. Из рибосомной структуры мы исключили все нуклеотиды, составляющие известные сайты, а также все нуклеотиды в пределах 10 Å от r-белка. Этот анализ исключения дал 4 кластера нуклеотидов ET с высоким рангом на поверхности рибосомы, три в 23S и один в 16S (рис. 7).Нуклеотиды ET в этих кластерах (перечислены для каждого кластера в таблице S5) не описаны в литературе и не имеют очевидного функционального значения. Мы предполагаем, что кластеры в 23S могут служить сайтами связывания регуляторных белков и шаперонов или сайтами рибосомного процессинга во время созревания и сборки. Между тем, кластер ET в 16S расположен рядом со спиралью h5, которая действует как сайт связывания для нескольких факторов трансляции [61, 62]. Следовательно, возможно, что нуклеотиды в этом кластере участвуют в аллостерической регуляции трансляции.Эти данные показывают, что структурный анализ под контролем ET может указывать на представляющие интерес сайты даже в хорошо изученных системах, таких как рибосома.

Рис. 7. ET-кластеры неизвестного функционального значения.

Кластеры (A-C) в 23S рРНК могут служить сайтами связывания для регуляторных белков, тогда как кластер (D) в 16S находится близко к сайту связывания фактора трансляции и, следовательно, может играть роль в трансляции. Нуклеотиды белого цвета являются либо известными функциональными сайтами, либо находятся в пределах 10 Å от r-белка и поэтому исключены из анализа.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g007

Таким образом, мы обнаружили, что нуклеотиды ET кластерируются в структуре рибосомы, и что основной кластер ET четко определяет основные функциональные сайты молекулы. . Кроме того, рейтинг ET также предполагает сайты связывания белков и антибиотиков. Мы также показываем, что нуклеотиды ET более высокого ранга обогащены для инактивации мутаций и посттранскрипционно модифицированных оснований. При обнаружении этих участков ET более точен, чем консервация (S7 Рис).Наконец, поскольку эти данные показывают, что модель ET применима к рибосоме, мы предлагаем несколько потенциально новых сайтов.

Обобщение модели

Тематические исследования с головкой молотка и рибосомами согласуются с двумя фундаментальными свойствами ET: то, что первые места группируются структурно, тем самым выявляя функциональные сайты. Чтобы оценить общность этих характеристик, ЕТ была затем протестирована на семействах РНК в базе данных Rfam. Мы выбрали 1070 семейств РНК, которые имели по крайней мере 10 канонических последовательностей в их выравнивании семян Rfam.Этот набор РНК включал широкий выбор классов, включая рибопереключатели, тРНК, РНКзимы, вирусные частицы, малые регуляторные РНК и днРНК (рис. 2А). Кроме того, среди них 71 семейство, которые могут быть объединены по крайней мере с одной структурой высокого разрешения. Каждое выравнивание отслеживалось, и трасса оценивалась на предмет кластеризации среди оснований ET в зависимости от покрытия ET.

Сначала мы оценили структурированный набор с высоким разрешением и обнаружили, что в среднем нуклеотиды ET восстанавливают 24% всех контактов третичной структуры по сравнению с 13%, которые могут быть восстановлены при случайном выборе (см. Таблицу S6A).В 64 из 71 РНК это соответствовало среднему z-баллу кластеризации, превышающему 2, что указывает на то, что ET обнаруживает кластеры эволюционно важных нуклеотидов (рис. 8A, белый цвет). Этот набор состоял из хорошо упорядоченных полноразмерных структур, включая рибопереключатели, РНКазу P, каталитические интроны, рибозимы и рРНК (Fig 2B ) . Примечательно, что рибосомная и сплайсесомная РНК демонстрируют более высокие баллы z по сравнению с остальной частью набора (14 или более), что указывает на большие и важные для эволюции основные функции.Затем мы исследовали 7 семейств Rfam, в которых не обнаружено структурной кластеризации по нуклеотидам ET. Три из этих семейств были небольшими вирусными структурами (приблизительно 30 нуклеотидов в длину), обнаруженными в РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Их выравнивание последовательностей состояло из очень похожих последовательностей (средняя идентичность последовательностей 91%), а их узкий филогенетический объем препятствовал значимому анализу ET. Напротив, средняя идентичность последовательностей в успешных примерах составляла 64%. Наконец, в каждом из оставшихся 4 семейств, которые работали плохо, кластеризацию нельзя было полностью оценить, потому что их наиболее согласованные структуры были фрагментом молекулы полной длины.В целом, однако, эти данные показывают, что модель соответствует наблюдениям в 90% фнкРНК, которые мы смогли протестировать. Неудачи редко, но постоянно связаны с отсутствием структурного контекста или дефицитом эволюционной информации из-за отсутствия достаточно расходящихся последовательностей.

Рис. 8. Кластеризация нуклеотидов ET и их перекрытие с функциональными сайтами является общим.

Z-оценка выше 2 указывает на статистически значимую кластеризацию и перекрытие. На (A) показаны совокупные данные кластеризации ET для 1070 молекул РНК.Кластеризация ET обнаруживается в 62% первичных последовательностей, 83% вторичных структур и 91% третичных структур. В подгруппе из 15 таких молекул (B) мы измеряем перекрытие с известными функциональными сайтами. В 12 из 15 тестовых случаев перекрытие является значительным.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g008

Затем, чтобы протестировать ET для РНК без известных трехмерных структур, что составляет 93% от нашего тестового набора, кластеризация базовых ET была оценена в первичная последовательность (1-мерная) и в моделях вторичной структуры, предоставленных Rfam (2-хмерная).83% вторичных структур (рис. 8A, серый) показали кластеризацию ET с более чем 2 (в соответствии с нашим наблюдением в третичном наборе, нуклеотиды ET восстановили в среднем 27% контактов вторичной структуры, при этом 17% ожидались случайно, см. таблицу S6B). Немногочисленными выбросами с большими z-значениями снова оказались субъединицы рРНК и сплайсосомы. Кластеризация ET также может быть обнаружена в большинстве первичных последовательностей, 62% которых достигают 2 (рис. 8A, черный). Эти данные показывают, что хотя вторичные и первичные структуры лишены детального трехмерного контекста, они тем не менее обнаруживают кластеры нуклеотидов ET.Одно из возможных применений этого свойства — использовать кластеризацию ET в предсказанных вторичных структурах, чтобы различать плохие и надежные модели.

Наконец, из 71 семейства РНК, протестированных на трехмерную кластеризацию ET, мы выбрали 15 для анализа функциональных сайтов. Они включали рибозим «головка молотка», две рибосомные субъединицы, тРНК, РНКазу P, самосплайсинговые интроны группы I и 9 рибопереключателей. Для каждой из этих молекул мы провели поиск в литературе канонических функциональных сайтов (см. Таблицу S1), а затем вычислили их перекрытие с основаниями ET (рис. 8B).В 12 из 15 случаев z-показатель перекрытия функциональных сайтов был выше 2,0. В двух случаях, рибопереключатель THF и рибопереключатель PreQ1 (RF01831 и RF00522), перекрытие приблизилось к значимости с = 1,86 и 1,84. Наконец, z-оценка перекрытия функциональных сайтов составила 1,44 для рибопереключателя FMN (RF00522). Интересно, что его исходное выравнивание содержало ряд неправильно выровненных последовательностей; их удаление и восстановление увеличились с 1,44 до 1,9.

Вместе эти анализы кластеризации и перекрытия ET подтверждают, что модель ET является общей и применима к широкому диапазону функциональных РНК.

Оптимизация выбора последовательности повышает производительность

Поскольку в РНК, ET выполняет те же свойства кластеризации и перекрытия функциональных сайтов, что и в белках, возможно, это аналогичным образом улучшение качества структурных кластеров может привести к улучшению качества предсказаний функциональных сайтов? В белках эти два фактора сильно коррелируют. В результате улучшения в кластеризации ET могут быть использованы для оптимизации выбора последовательностей, что, в свою очередь, приводит к лучшему восстановлению функциональных сайтов [41] с важным практическим ответвлением на оптимизацию анализов [42].

Чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили два разных показателя качества кластера: z-показатель кластеризации ET, как описано ранее, и гладкость ET. Гладкость ЕТ — это совокупная разность рангов ЕТ между всеми соседними нуклеотидами в структуре (что означает, что более низкие абсолютные значения гладкости соответствуют более плавному распределению рангов). Эта мера отражает плавность эволюции по всей структуре и является более целостной метрикой, чем средняя базовая кластеризация ET [43].

Мы проверили взаимосвязь между метриками кластеризации и качеством предсказания в 15 семействах РНК с тщательно подобранными функциональными сайтами. Для каждой семьи мы сгенерировали набор из 1000 выравниваний путем случайного перемешивания баз в исходном выравнивании. Мы проследили выравнивания и измерили их гладкость, а также их среднюю общую кластеризацию и z-баллы перекрытия, 〈 z _o 〉 и 〈 z _c 〉. Затем мы объединили выравнивания по частоте их перемешивания и усреднили оценки, как показано на рис. 9A для рибопереключателя glmS.Как видно из примера с glmS, когда мы вводим ошибки в выравнивание, перекрытие ET, кластеризация и гладкость ухудшаются сильно коррелированным образом. В 15 тестовых случаях средняя корреляция между перекрытием ET и кластеризацией составила r = 0,95 и r = -0,96 между перекрытием и гладкостью (рис. 9B).

Рис. 9. Оптимизация входных согласований с помощью кластеризации ET и сглаживания улучшает перекрытие.

Ухудшение выравнивания glmS на (A) показывает, что кластеризация и гладкость коррелируют с перекрытием.Применение этого анализа к 15 молекулам с аннотированными функциональными сайтами показывает, что корреляции являются общими (B). Это говорит о том, что выбор последовательности может быть оптимизирован для более эффективного ранжирования ET. Это показано на (C), где мы используем две разные меры кластеризации, чтобы выбрать выравнивания, которые дают более точные предсказания функционального сайта, чем начальные выравнивания.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007583.g009

Корреляция между структурным качеством трассы и перекрытием имеет практическое значение, поскольку гладкость и кластеризация ET могут использоваться как косвенные меры точности трассировки.Оптимизируя выравнивание трасс для максимальной гладкости (или кластеризации ET), мы, по-видимому, также максимизируем точность прогнозирования активных сайтов. Мы проверили эту гипотезу на девяти тестовых рибопереключателях. Для каждого рибопереключателя мы сгенерировали начальное выравнивание, отличное от начального, и основанное на 500 последовательностях, выбранных случайным образом из полного репозитория последовательностей семейства на Rfam. Используя эти выравнивания в качестве эталона, мы затем сгенерировали для каждого рибопереключателя ансамбль из 5000 выравниваний путем удаления случайного числа последовательностей 0 (где N — размер выравнивания) из эталона.Затем мы проследили каждое выравнивание и вычислили его гладкость ET, z-оценку кластеризации ET и z-оценку перекрытия ET. Наконец, мы выбрали из случайного ансамбля, выравнивание, которое имеет наиболее гладкую ET или самую высокую кластеризацию ET. Затем мы сравнили z-баллы перекрытия, полученные в результате выравнивания, оптимизированного для гладкости и кластеризации, с исходными выравниваниями Rfam.

Как ни удивительно, мы обнаружили, что в 8 из 9 случаев оптимизация с помощью плавности ET привела к снижению производительности, в среднем на 13%.Чтобы объяснить это поведение, мы исследовали наиболее гладкие выравнивания и обнаружили, что оптимизация выбрала выравнивания, состоящие из небольшого числа высокоинвариантных последовательностей. Эти выравнивания принесли в жертву филогенетическое разнообразие в обмен на очень плавное, но неинформативное ранжирование высококонсервативных нуклеотидов в ET. Чтобы решить эту проблему узкого филогенетического охвата, мы ввели ранговую энтропию (RE), которая измеряет частоту ( от ) каждого ранга ET ( r ) в выравнивании.RE является максимальным, когда каждому столбцу назначен уникальный ранг, и равен нулю, когда выравнивание полностью сохраняется.

Нормализация RE и ET Smoothness до 1, а затем использование их продукта в качестве единой меры (RE × SMT), спасла производительность оптимизации в 8 из 9 случаев, что дало среднее улучшение качества прогнозирования на 9% (рис. 9C, пунктирные линии). Наконец, мы протестировали кластеризацию среднего ET в качестве показателя оптимизации. Мы обнаружили, что максимальное увеличение среднего z-показателя кластеризации ET привело к выравниванию, которое дало среднее улучшение на 24% (рис. 9C, сплошная линия).Z-оценка кластеризации ET работает лучше, чем показатели, основанные на гладкости, потому что она выражает значимость кластеризации нуклеотидов ET относительно остальной структуры. Когда консервативная ячейка ET доминирует в следе (вероятность кластеризации нуклеотидов ET выше), это приводит к большему ожидаемому весу кластеризации, большему стандартному отклонению и, как результат, более низкому z-баллу кластеризации, что делает этот показатель более чувствительным, чем исходный. ЕТ гладкость.

Примечательно, что оптимизированные полные выравнивания также превзошли вручную курируемые выравнивания семян Rfam, которые используются в эксперименте по предсказанию базового функционального сайта на рис. 8.Хотя полные выравнивания, которые мы использовали для оптимизации, уже лучше, чем начальное (улучшение на 10% z-показателя перекрытия из-за более разнообразного набора последовательностей), оптимизация еще больше увеличивает разрыв в производительности. Оптимизация с помощью гладкости, скорректированной по рангу, привела к выравниванию, которое лучше, чем начальное при обнаружении функционального сайта в 6 из 9 случаев (среднее улучшение 21%), а оптимизация с помощью кластеризации ET дала лучшие сопоставления, чем начальное значение во всех 9 случаях (среднее улучшение 30% над семенами). Чтобы в дальнейшем проверить, можем ли мы оптимизировать вручную курируемые выравнивания, мы применили два метода оптимизации к множественным выравниваниям последовательностей, используемым в тематическом исследовании рибосом.Измеряя точность по совокупности всех функциональных сайтов, мы обнаружили, что оптимизация с помощью сглаживания, скорректированной по рангу, улучшила точность прогнозирования в малой субъединице со среднего 0-35% перекрытия ЕТ z-балла z = 2,38 до z = 2,60, а в большой субъединице. привело к уменьшению с z = 6,95 до 6,80. Однако оптимизация с помощью кластеризации ET повысила точность в обеих субъединицах, до z = 3,32 в малой субъединице и z = 7,20 в большой субъединице соответственно. Вместе эти данные показывают, что оптимизация входных согласований возможна и полезна.

Таким образом, выбор последовательности может быть оптимизирован для достижения лучшего восстановления активного сайта. Входные последовательности являются основным фактором, влияющим на качество трассировки. Используя кластеризацию ET и гладкость RE в качестве косвенных мер, мы можем удалить последовательности, которые либо слишком филогенетически далеки, либо ошибочны. Таким образом мы можем повысить качество трассировки и более точно предсказать активные сайты.

Заключение

Более 50 лет назад Карл Вёзе и Фрэнсис Крик выдвинули гипотезу о том, что РНК может служить предшественником ДНК и белков [63], и с тех пор было обнаружено, что РНК выполняют множество функций внутри клетки.Здесь мы показываем, что сходство между функциональными РНК и белками — это не просто предмет анекдотического сходства. Мы утверждаем, что это сходство основано на фундаментальном принципе отбора, который управляет эволюцией функций как РНК, так и белков. Точно так же, как эволюционно важные аминокислоты в белках, эволюционно важные нуклеотиды РНК развиваются в компактные, неслучайные кластеры, которые определяют функцию молекулы. Как мы показали в ряде примеров, включая «голову молотка» и рибосому, эти кластеры соответствуют каталитическим сайтам, карманам для связывания лигандов и межмолекулярным границам раздела и обогащены для инактивации мутаций и модифицированных нуклеотидов.Эти основные свойства подчеркивают взаимосвязь между последовательностью, структурой и функцией в структурированных РНК и предполагают, что можно идентифицировать новые функциональные сайты в структурированных молекулах РНК с помощью анализа эволюционных следов.

Кроме того, мы демонстрируем, что существует количественная корреляция между образованием кластеров и восстановлением функциональных сайтов. Эта корреляция напрямую зависит от кластеризации ET и гладкости ET, которые измеряют сходство эволюционной истории в соседних аминокислотах или нуклеотидах.В структурированной РНК, как и в белках, эволюция стремится минимизировать ранговые различия между соседними нуклеотидами. Это приводит к образованию гладких кластеров, информирующих функцию. На практике это свойство позволяет нам максимизировать точность предсказания ET путем построения выравнивания, которое максимизирует пространственную кластеризацию и гладкость нуклеотидов ET.

Интересно, что мы также обнаружили некоторую взаимодополняемость между анализом ET и ковариацией. Чтобы показать это, мы сравнили ET с R-scape [64], инструментом ковариационного анализа, в бактериальной РНКазе P.Мы применили R-scape для выравнивания последовательностей РНКазы P и обнаружили 74 пары оснований (148 нуклеотидов) со значительной ковариацией (значение e R-scape <0,05). Мы напрямую построили графики ковариационных весов R-scape этих 148 нуклеотидов против их весов ET, показанных на рис. S8A. Мы сразу же обнаружили корреляцию между оценкой ET и оценкой R-scape (коэффициент корреляции r = 0,47), что указывает на то, что высококовариантные позиции будут иметь тенденцию иметь низкий балл ЕТ, и наоборот. Во-вторых, как показано на фиг. S8B, мы обнаруживаем очень небольшое перекрытие между верхними нуклеотидами ET и 148 нуклеотидами высокой ковариации.Наконец, эти две в основном не перекрывающиеся группы нуклеотидов, по-видимому, модулируют разные функции, как показано на рис. S8C. Эти данные показывают, что оценки ET и оценки ковариации R-scape в этом примере в значительной степени дополняют друг друга, и мы оставляем для будущего исследования более глубокое рассмотрение этих сравнений, чтобы понять, насколько хорошо они обобщают.

Поскольку это исследование сосредоточено на хорошо известных структурированных РНК, не совсем ясно, являются ли свойства ET общими для всех классов РНК, особенно новых классов, таких как lncRNA, которые имеют слабую связь между последовательностью, структурой и функцией.Однако в случаях, когда интересующая РНК хорошо представлена ​​набором разнообразных гомологов, исследователи смогут использовать ET в качестве ориентира для нуклеотидов-мишеней для функционального анализа. Мы ожидаем, что потребность в таком анализе будет расти в будущем, поскольку объем исследований РНК продолжает расширяться. Наконец, некоторые свойства, описанные здесь для РНК, можно транслировать непосредственно на другие полимеры, в частности, на ДНК. Схема оценки ET для оценки эволюционирующих полимеров является универсальной и может использоваться в геномных последовательностях для определения функциональных локусов в некодирующих областях.

Evolution путем естественного отбора | manoa.hawaii.edu/ExploringOurFluidEarth

Введение в эволюцию путем естественного отбора

По оценкам ученых, без физического подсчета бактерий и вирусов на Земле сегодня обитает более 8,7 миллионов видов организмов. Происхождение и исчезновение такого количества видов очаровывало ученых на протяжении тысячелетий, еще со времен Древней Греции. Большое разнообразие живых организмов на Земле лучше всего объясняется научно обоснованной концепцией эволюции путем естественного отбора.

Выплачено

Видео

Практикум: Введение в естественный отбор