Соотнесите особенности процессов биосинтеза белка и фотосинтеза: В 2. Соотнесите особенности процессов биосинтеза белка и фотосинтеза Особенности процесса

CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

ПРОРЫВНЫЙ ОТЧЕТ — крупномасштабное измерение скорости синтеза белка в течение суточного цикла выявило специфическую регуляцию трансляции, специфичную для каждого пути

Резюме

У растений суточное разделение метаболических потоков и потребность в дифференцированном обслуживании белковых механизмов днем ​​и ночью .Для непосредственной оценки трансляции и деградации агрегированных белков для конкретных белков и оценки задействованных вложений АТФ индивидуальные скорости синтеза и разложения сотен различных белков были измерены в розетках Arabidopsis thaliana . Эта количественная оценка контроля трансляции посредством включения тяжелого водорода во вновь синтезированный белок подтвердила, что большая часть синтеза белка происходит в дневные часы (~ 3: 1 день: ночь), но показала, что он сильно различается по функциональным категориям.Белки, участвующие в фотосинтезе, особенно компоненты светособирающих комплексов, синтезировались намного быстрее днем ​​(~ 10: 1), в то время как белковые компоненты метаболизма углерода и перемещения пузырьков транслировались с одинаковой скоростью днем ​​и ночью. Сравнение агрегированной трансляции с рядом сопоставимых исследований с использованием полисомальной загрузки транскриптов или изобилия транскриптов предполагает, что контроль трансляции является основным фактором эффективной экспрессии генов в течение дневного цикла.Наблюдалось, что суточная скорость деградации белка тесно координируется со скоростью синтеза белка, поскольку количество белков в листьях изменяется в изобилии, несмотря на снижение скорости трансляции в течение ночи. Прямой, количественный и совокупный анализ синтеза белка обеспечивает интеграцию транскрипционного, посттранскрипционного и трансляционного контроля гомеостаза протеома листа и дает возможность оценить вовлеченные вложения АТФ. Данные показывают, как приостановка синтеза и деградации фотосистемы в ночное время позволяет перенаправить уменьшенный энергетический баланс на выборочный график обслуживания в ночное время.

Краткое содержание в одном предложении Достижения в сборе и обработке данных по включению стабильных изотопов позволили охарактеризовать дифференциальные скорости синтеза белка в течение суточного цикла, которые выявили как глобальные, так и специфические программы регуляции трансляции основных биохимических путей.

Введение

Когда, где и с какой скоростью выражается генетическая информация, являются важными детерминантами успеха организма. Сообщается подробная информация о некоторых элементах этого процесса в модельных организмах; е.грамм. последовательности генома, статус модификации генома, скорость и количество транскрипции, количество белков и посттрансляционные модификации. Однако сравнительно мало известно о ключевом этапе энергетической приверженности в этом процессе: скорости трансляции определенных белков. По сравнению с транскрипцией перевод — дорогостоящий процесс; потребляя по крайней мере на порядок больше АТФ, чем транскрипция (Wagner 2005). На некоторых стадиях развития растений на трансляцию всех белков приходится до 38% доступного респираторного АТФ (Li et al.2017). В системах млекопитающих, которые имеют сравнительно стабильные энергетические условия, эта стоимость минимизируется преимущественно за счет контроля, управляемого транскриптами (Li, Bickel, and Biggin, 2014). Однако в отношении растений имеются веские доказательства того, что это не так; возможно, из-за сильно различающейся доступности энергии, вызванной фотосинтезом в дневно-ночном цикле. Напротив, данные указывают на то, что в дневные часы происходит гораздо больший синтез белка, чем в ночное, несмотря на очевидные, но численно меньшие колебания в изобилии транскриптов или полисомной нагрузке в течение одного и того же цикла (Ishihara et al.2015; Piques et al. 2009 г.).

Недавние исследования Arabidopsis были сосредоточены на ассоциации транскриптов с рибосомами в качестве косвенного измерения трансляции кодируемого белка (Juntawong et al. 2014; Missra et al. 2015; Yamasaki et al. 2015). Это мощный метод из-за его общей применимости, совместимости с основными технологиями секвенирования нуклеотидов и глубины анализа. Однако в качестве косвенного, а не прямого измерения; множественные уровни регуляции могут нарушить корреляцию этих измерений с трансляцией белка и, следовательно, с функцией клетки.Например, Missra et al. (2015) показали, что транскрипты, кодирующие компоненты цитозольной рибосомы, находятся в состояниях высокой трансляции ночью, тогда как измерения количества рибосом в конце дня и в конце ночи показывают, что они не накапливаются в течение этого периода (Pal et al. 2013). Учитывая, что деградация субъединиц рибосомного белка в основном равномерная и медленная (Salih et al.2020; Li et al.2017), это говорит о том, что имели место либо бесплодные и дорогостоящие циклы синтеза / деградации, либо регуляция, не улавливаемая измерениями состояния трансляции мРНК ( Missra et al.2015).

Ранее прекомические исследования, в которых измеряли трансляцию белка и полисомную ассоциацию транскриптов, показали, что существует значительное разнообразие регуляции, происходящей как в ассоциации транскриптов с рибосомами, так и при инициированной трансляции. Исследования регуляции CATALASE ISOZYME 2 (CAT2) в Zea mays показали, что, хотя количество транскриптов и полисомальная ассоциация были одинаковыми как в темноте, так и на свету, белок вырабатывался только на свету (Skadsen and Scandalios 1987).Сходным образом, чувствительный к свету трансляционный контроль экспрессии RUBISCO был продемонстрирован у Amaranthus hypochondriacus , где трансляция предшествовала регуляции транскрипции при переходах от темноты к свету (Berry et al. 1986). Регулирование трансляции пластид ФЕРРЕДОКСИН-1 (Fed-1) на основе света относительно хорошо изучено, поскольку транскрипт связан только с рибосомами на свету в отсутствие ингибиторов фотосинтетического потока (Petracek et al. 1997) из-за присутствия расположенный в 5’UTR элемент светового ответа мРНК, который способен обеспечивать световую регуляцию любой связанной открытой рамки считывания (Hansen et al.2001). Понимание этих сложных механизмов посттранскрипционной регуляции было построено путем измерения как входа, так и выхода рибосомы, а не только одной стороны уравнения.

Однако возможности исследовать агрегированную трансляцию белка затрудняла трудоемкость проведения трансляционных измерений; большинство исследований включали инкубацию тканей растений с радиоактивно меченным Met с последующей иммуноосаждением целевого белка и разделением на основе геля с последующей радиоденситометрией.Эти методы трудны для отдельных белков и ограничены по масштабу, но в некоторых случаях они дают понимание сложных механизмов посттранскрипционной регуляции (Qi et al. 2011). Стабильные изотопы, поставляемые в форме неорганических соединений, были использованы с хорошим эффектом для измерения скоростей общего синтеза белка в суточных циклах (Ishihara et al., 2015) и индивидуальных темпов синтеза белка в течение дней (Li et al., 2017; Nelson et al. др.2014). Вообще говоря, мечение растений ¹⁵ N работает очень неэффективно в ночное время из-за преобладания ферредоксин-связанного восстановления нитрата в пластиде как средства ассимиляции азота (Li et al.2017; Нельсон и др. 2014) и ¹³ CO ₂ мечение фактически отсутствует в ночное время из-за отсутствия фотосинтеза. Эти соображения ограничивают способность любой метки легко фиксировать подробный каталог ночных эффектов на синтез белка.

Имея в виду эти ограничения, мы использовали способность ² H в воде быстро ассимилироваться в пул аминокислот как днем, так и ночью, а также протеомику на основе масс-спектрометрии, чтобы обеспечить разрешенные по времени, специфичные для белков оценки белков. перевод и деградация в течение цикла день / ночь.Этот подход дополняет трансляцию и деградацию белка на уровне общего пула и специфичные для генов измерения полисомной ассоциации мРНК, чтобы обеспечить более полную оценку процесса трансляции со стороны белка. Совокупный характер данных также позволяет включить метаболические, связанные с развитием и физиологические реакции на доступную энергию при интерпретации данных о трансляции белков. Энергетически дорогостоящие процессы, которые необходимы только днем, лучше всего проводить на свету, когда энергии много, в то время как сокращенный набор основных функций может нуждаться в поддержании или усилении без истощения запасов крахмала ночью.

Результаты

Определение скорости синтеза и деградации белка в дневное и ночное время

Трехнедельный возраст Arabidopsis thaliana Растения Col-0 выращивали на гидропонике при дневном цикле 12 часов свет / 12 часов темноты. За сорок пять минут до включения света дневные меченые растения переносили в сильно меченую (5% ² H ₂ O / 95% H ₂ O) среду Хогланда. При выключенном свете собирали целые розетки, закаливали в жидкости N ₂ и хранили в качестве образца на конец дня.За сорок пять минут до этого вторую группу растений переносили в 5% ² H ₂ O и выращивали в течение 12-часового темного периода перед отбором образцов непосредственно перед включением света, что представляет собой образец конца ночи. Соответствующие образцы, выращенные в 100% H ₂ O Hoagland, собирали в конце дня и в конце ночи. Белки из этих образцов были извлечены, переварены и проанализированы стандартными методами масс-спектрометрии, зависящими от данных (рис. 1а).

(a) Приблизительно 216 растений Arabidopsis thaliana выращивали в среде Хогланда в течение 12 часов дня / 12 часов ночи в течение 21 дня. Утром 21-го дня три лотка, в каждом из которых содержалось по 24 растения, переносили в среду, содержащую 5% ² H ₂ O перед отбором образцов в конце дня. Второй набор из 72 растений метили в течение 12 часов ночи, в то время как одновременно выращенные немеченые растения отбирали образцы в конце дня и в конце ночи. Белки экстрагировали, расщепляли, фракционировали и анализировали с помощью стандартной масс-спектрометрии, зависящей от восходящих данных.(b) Меченые и немеченые серии были выровнены по времени удерживания, и признаки MS ¹ с соответствующими идентификациями пептидов были перекрестно экстрагированы между тремя повторностями растений, меченных днем, и тремя повторностями растений, меченных ночью. (c) Было извлечено относительное содержание каждого изотополога. (d) Расчетные популяции изотопологов при обогащении ² H в диапазоне от естественного содержания до 6%. Комбинации этих популяций в различных относительных пропорциях сравниваются с экспериментально измеренными данными до тех пор, пока не будет найдена комбинация, которая минимизирует невязку между экспериментальными и расчетными.Относительная доля популяций неприродной численности оценивает долю вновь синтезированного пептида за период мечения.

Включение ² H в белок измеряли, наблюдая сдвиги в относительных количествах изотопологов идентифицированных пептидов. MS ² идентификация MS ¹ признаков в немеченых образцах были перенесены на выровненные по времени удерживания меченые образцы, что позволило извлечь относительные количества изотопологов известного элементного состава из растений, выращенных днем ​​или ночью (рис. 1b).Эта стратегия маркировки произвела более тонкие сдвиги в изотопных оболочках, чем предыдущие исследования, например. 100% ¹⁵ N, но этого было достаточно для воспроизводимых измерений (Nelson et al., 2014; Li et al., 2017). Информация сканирования MS, собранная +/- 2 секунды от пика элюции каждого пептида, была усреднена вместе для создания относительного профиля изотополога (рис. 1c). Форма этой оболочки для пептида известного элементного состава модифицируется за счет обогащения ² H в пуле аминокислот и соотношением присутствующего меченого и немеченого пептида.Интерпретация этих форм была решена путем повторения комбинаций и пропорций обогащенных и естественных популяций численности, чтобы минимизировать невязку между смоделированными и экспериментальными данными с помощью алгоритма неотрицательной регрессии наименьших квадратов, как было продемонстрировано ранее (Nelson et al.2014; Li et al. 2017) (Рисунок 1d).

Было показано, что происходит несинтетическое включение дейтерия в белки посредством реакций водородно-дейтериевого обмена. Эти обмены происходят быстро в боковых цепях, медленно в основной цепи амина и совсем не происходят в незаменяемых положениях.Для сохранения этих обменов посредством восходящей подготовки протеомных образцов требуются специально оптимизированные условия (Konermann et al. 2011). Низкая концентрация ² H в используемых здесь средах для маркировки, короткий период маркировки и широкие возможности для обратного обмена после удаления ² H из растворителей образца во время денатурации, протеолиза, фракционирования, хранения и анализа в сочетании с отсутствием мер по сохраненный обмен ² H эффективно устраняет возможность обмена дейтерия, способствующего наблюдаемой маркировке.Обратный обмен водорода на метаболически включенный ² H, вероятно, действительно происходит в обмениваемых положениях, однако абсолютное количество присутствующих ² атомов H и относительное обогащение каждого пула аминокислот не имеют прямого отношения к новой: старой оценке сделано здесь; только этот новый белок содержит значительное количество тяжелых изотопов, превышающее естественный уровень.

Этот анализ предоставил информацию о соотношении пептида, синтезированного во время периода мечения, к тому, который был синтезирован до него.Для определения скорости синтеза также требовался размер пула белков в начале и в конце периода мечения. Размер каждого пула белков отслеживали с помощью связанного количественного эксперимента, в котором немеченые образцы в конце ночи и в конце дня добавляли в соотношении 1: 1 полностью ¹⁵ N меченой эталонной смесью протеома. Эта смесь была получена из растений, выращиваемых параллельно в среде, меченной ¹⁵ N из семян. Этот рабочий процесс позволил определить соотношение вновь синтезированного и уже существующего белка из прогрессивно меченных образцов и определить относительные изменения размера пула из полностью меченых пиков в образцах для каждого белка.Затем эти измерения были взвешены по абсолютной численности (Wang et al. 2015) и общему количеству белка на розетку, чтобы дать измерение абсолютного синтеза и скорости разложения на розетку в свету и темноте в течение 24-часового дневного цикла.

Данные о содержании пептидов и включении изотопов были собраны в списки белков двумя способами. Первый сгенерировал данные включения для каждой повторности и собрал окончательное измерение белка из среднего из трех повторностей.Из-за стохастической вариации в получении данных масс-спектрометрии, с помощью этой методологии можно было бы сообщить о меньшем наборе белков, чем при окончательном измерении белка путем непосредственной сборки измерений пептидов из трех повторов. Прямая сборка привела к синтезу и разложению белков примерно для 350 белков (дополнительная таблица S1). Хотя 350 по-прежнему численно составляет небольшую долю от общего числа белков, кодируемых в геноме Arabidopsis, из-за выбора масс-спектрометрии, зависящей от данных, эти 350 белков составляют примерно 40% от общего количества белка в зрелых розеточных листьях. к оценкам молярного отношения, полученным из paxdb (pax-db.org) (Ван и др., 2015). Эту методологию проводили в трех биологических повторностях, и каждый повтор состоял из розеток по крайней мере четырех растений. Двенадцать часов обработки 5% ² H ₂ O не оказали заметного воздействия на фенотип растений или скорость роста листьев в последующие дни (Рисунок S1). Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, в которых было показано, что низкие концентрации ² H ₂ O оказывают минимальное влияние на рост растений (Sideris, Mukherjee, and Vomvoyanni 1975, Yang et al.2010; Zachleder et al. 2018).

Получив скорости синтеза для каждого белка относительно размера его пула и проследив относительный размер пула для каждого белка в течение суточного цикла, данные молярного отношения Pax-db были использованы для определения размера каждого пула относительно общего содержания белка (Wang et al. др. 2015). Эта серия вычислений дала скорость синтеза для каждого белка в расчете на общее количество белка, то есть K _s на грамм белка. Общее содержание белка в розетках арабидопсиса на 21 день ранее было определено как 2% от сырой массы (Li et al.2017). Поскольку содержание воды в молодых растениях существенно меняется в течение дневного / ночного цикла, был использован средний свежий вес по всем образцам. Абсолютные скорости синтеза и разложения были получены из этих цифр и произведен расчет общего количества АТФ, необходимого для поддержания этого уровня белкового обмена. Эти измерения предполагали, что для каждой пептидной связи при синтезе требовалось 5,25 молекулы АТФ, а для разрушения каждой связи требовалось 1,25 молекулы АТФ (Kaleta et al.2013; Pal et al.2013). Эти цифры показывают, что для измеренных здесь белков днем ​​образуется примерно в три раза больше пептидных связей, чем ночью (рис. 2а). Соотношение включения в дневное и ночное время измерялось ранее на уровне общего пула белков посредством маркировки ¹³ CO ₂ (Ishihara et al. 2015). Измерения включения ¹³ C проводили путем выделения общего белка перед кислотным гидролизом и определения изотопного соотношения аминокислот с помощью ГХ-МС.Оба метода обеспечивают одинаковое соотношение дневной и ночной скорости синтеза белка три к одному.

(a) Общее количество пептидных связей, необходимых для поддержания скорости синтеза белка, наблюдаемой при включении ² H, рассчитывали для каждой розетки, полосы погрешностей представляют собой стандартную ошибку. (b) Распределение пропорций каждого пула белков, синтезированных в течение 12 часов дня (желтый) или 12 часов ночи (синий).

Существенным преимуществом представленного здесь подхода ² H является возможность определять конкретные различия в скорости синтеза между различными белками. Мы исследовали пропорцию каждого пула белков, синтезируемого днем ​​и ночью, и обнаружили, что оба были положительно искаженными распределениями со стандартными отклонениями, превышающими медианные значения, лежащие в основе 53-кратного диапазона значений в ночное время и 42-кратного диапазона значений дневного времени ( Рисунок 2b, дополнительная таблица S1). Средняя доля каждого белка, синтезированного за день, составила 19.3%, в то время как ночью было 11% (средняя разница 8,26%, p 5.4e ^-25 , t-критерий). Более высокий перекос в дневном распределении показал, что дневные и ночные программы синтеза не были аналогичными, даже если сдвиги в среднем не учитывались. Мы исследовали эту разницу, сравнивая положения обеих функциональных категорий и отдельных белков в распределениях между днем ​​и ночью.

Тенденции программы дневного и ночного трансляции

Разделение 350 белков, скорость обмена которых измерялась как в свете, так и в темноте, на функциональные категории показало, что величина снижения скорости синтеза в ночное время не была равномерной (Thimm et al.2004 г.). Хотя скорость трансляции всех измеренных категорий была значительно выше на свету (t-тест, p <0,05), такие категории, как окислительно-восстановительный гомеостаз, дыхание и модификация белков (в 1,4, 1,4 и 1,3 раза выше при освещении), показали меньший день / ночные различия, чем фотосинтез, метаболизм аминокислот и синтез белка (в 2,3, 3,0, 1,8 раза выше на свету) (рис. 3а). Наблюдаемое расхождение в соотношении дневной и ночной скорости синтеза между функциональными категориями предполагает, что регулирование скорости трансляции является специфическим регулируемым процессом.Грубые изменения в доступности субстрата или общих механизмов ингибирования трансляции должны подавлять или повышать скорость трансляции единообразно, вместо этого эти результаты предполагают, что регуляция трансляции контролируется более избирательно. Содержание белков на уровне функциональной категории либо не изменилось, либо изменилось очень мало в течение суточного цикла. Из категорий с более чем десятью членами в 350 измеренных белках только окислительно-восстановительный гомеостаз и синтез белка показывают значительные различия в их средних количествах (окислительно-восстановительный потенциал: кратное изменение 1.09, pval 0,0089, синтез белка: 1,039, pval 0,01) (рис. 3b). Эти результаты показали, что изменения в синтезе и деградации белка, наблюдаемые в течение дневного цикла, были в значительной степени сбалансированы, причем оба уменьшались в ночное время.

(a) Распределение доли каждого белка, синтезированного за 12 часов дня (желтый) или 12 часов ночи (синий), сгруппированных по ячейке Mapman. Представлены бункеры, в которых наблюдались десять или более членов категории.(b) Распределение кратного изменения содержания каждого белка от начала дня до конца дня (желтый) или от начала ночи до конца ночи (синий) (c) Доли белка, синтезируемого в выбранных подкатегориях система бункеров Mapman. Зеленый фон покрывает суб-бункеры, которые являются членами категории фотосинтеза. бежевый: окислительно-восстановительный гомеостаз, желтый: метаболизм углеводов, фиолетовый: клеточное дыхание, темно-зеленый: биосинтез белка.

Система бункеров Mapman (Schwacke et al. 2019) предлагает иерархическую структуру, в которой широкие функциональные категории разбиты на конкретные пути, комплексы и субъединицы.Мы изучили набор бинов, чтобы получить представление о том, как на уровне пути перевод имеет приоритет над суточным циклом (рис. 3c). Фотофосфорилирование показало более чем удвоенную скорость трансляции в дневные часы по сравнению с ночными часами, тогда как поддерживающие функции, такие как ферменты цикла Кальвина, фотодыхательные ферменты, окислительно-восстановительные регуляторы пластид и белки, поглощающие ROS, показали более сходные скорости трансляции днем ​​и ночью. Другие категории, которые показали небольшие различия в соотношении день / ночь, включали хорошо изученные пути с важными ночными функциями, такими как окислительное фосфорилирование, цикл TCA и удаление ROS.В соответствии с нашим выводом о том, что общая скорость трансляции была ниже ночью, было также обнаружено, что синтез факторов инициации, факторов элонгации и цитозольных и пластидных рибосомных компонентов ночью был сравнительно ниже.

Затраты на программу перевода дня и ночи

Кратные изменения в соотношении дневного и ночного синтеза варьировались от 86 раз быстрее на свету — ХЛОРОФИЛЛ А / В, СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛК 3 (CAB3), до 2,5 раза быстрее в темноте — ПЛАЗМА-МЕМБРАНА АССОЦИАЦИЯ КАТИОН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛК 1 (ATPCAP1).Как группа, белки светособирающего комплекса показали наибольшую разницу в скорости синтеза днем ​​/ ночью, при этом все измеренные члены были по крайней мере в десять раз быстрее на свету. Некоторые из белков с более высокой трансляцией в ночное время относятся к основным функциям митохондриального метаболизма; СЕРИНА ГИДРОКСИМЕТИЛТРАНСФЕРАЗА 1 (1,3 раза), ЦИСТЕИНСИНТАЗА C1 (1,3 раза), МАРГАНОВАЯ СУПЕРОКСИД ДИСМУТАЗА 1 (1,2 раза) и МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗА 1 (1,1 раза). Однако на обоих концах спектра трансляции доминировали пластидные белки.Те, которые переводились быстрее в течение дня, были в основном фотосинтетическими механизмами, а те, чей перевод был смещен в ночное время, имели более разнообразные функции; углеводный обмен, липидный обмен и поддержание РЕДОКС.

С точки зрения затрат в АТФ для синтеза каждого измеренного здесь белка, RBCL, субъединицы Photosystem II и RUBISCO-активаза были самыми дорогими вложениями в отдельные белки как днем, так и ночью, хотя их относительный рейтинг менялся в зависимости от условий (рис. 4а, б).Хотя величина вариации скорости синтеза день / ночь была большой, общий рейтинг вложений АТФ в различные белки хорошо сохранялся между днем ​​и ночью (корреляция Спирмена 0,91). Следовательно, заметное большое движение специфических белков в этих рядах наводит на мысль о суточной регуляции скорости трансляции либо за счет изобилия и загрузки транскриптов, либо за счет последующей регуляции. Подробные списки изменений ранга показаны в дополнительной таблице S2. Белки LHC показали наибольшее изменение стоимостных рангов — CAB3 сместился на 254 позиции в наборе из 350 белков.Ряд регуляторных белков также показал большие сдвиги в более высокий ранг в течение дня; ХОЛОД, ЦИРКАДИАННЫЙ РИТМ И РНК-СВЯЗКА 2 (CCR2) — известный белок циркадного цикла поднялся на 101 позицию (Карпентер, Крепс и Саймон, 1994), ТРАНСЛЯЦИОННО УПРАВЛЯЕМЫЙ ОПУХОЛЬНЫЙ БЕЛК 2 (TCTP2) — фактор обмена нуклеотидов в передаче сигналов TOR переместился на 96 позиций (Berkowitz et al. 2008), At1g13930 — неизвестный белок, ранее идентифицированный в QTL циркадного увлечения (Darrah et al. 2006), сдвинулся на 78 разрядов. Другие белки поднялись выше в ночном рейтинге; НАДФН-ЗАВИСИМАЯ ТИОРЕДОКСИН РЕДУКТАЗА С (NTRC) — центральный интегратор и регулятор РЕДОКС-метаболизма в хлоропластах (Spínola et al.2008) и регулятор утилизации крахмала посредством модуляции AGPase (Michalska et al. 2009) сдвинулся на 49 позиций. Белки, участвующие в метаболизме липидов, увеличили наибольшее количество позиций в ночное время: PATELLIN2, ответственный за обмен липидов между мембранами, поднялся на 133 позиции ночью, а ENOYL-ACP REDUCTASE 1, член комплекса синтазы жирных кислот, поднялся на 123 позиции выше.

(a) График разброса стоимости АТФ для достижения синтеза и разложения белка, наблюдаемого для каждой розетки днем ​​и ночью. На врезке — версия без кадра, на которой показаны самые дорогие белки за день. (b) Суммарное количество АТФ, необходимое для синтеза и разложения белка в расчете на белок днем ​​и ночью. Белки располагались в порядке убывания стоимости АТФ днем ​​(желтый) и ночью (синий). (c) Белки были упорядочены в порядке убывания стоимости АТФ днем ​​и ночью, и общее количество ранговых позиций, перемещенных по функциональной категории, было суммировано по каждой категории Mapman.Положительные числа относятся к более высокому общему рангу днем, отрицательные — к более высокому общему рангу ночью. (d) Сравнение стоимости АТФ пластидных белков, кодируемых в ядре и транслируемых в цитозоле (оранжевый) или кодируемых и транслируемых в пластиде (зеленый) днем ​​и ночью. Вложенный график представляет собой необрезанную версию основного графика, на которой выделены пять самых дорогих белков за день. Линии регрессии показывают линейные модели, подогнанные к набору данных цитозольных транслированных пластид, черным цветом, а транслированный набор пластид — зеленым.(e) Затраты АТФ на синтез и деградацию измеряемых белков, сгруппированных по их субклеточной локализации в дневное и ночное время. Цифры вверху указывают соотношение этих средних значений. (f) Стоимость АТФ каждого белка, кодируемого пластидой, измеренная днем ​​и ночью. Сокращения: RCA rubisco activase, RBCL рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза / оксигеназа (RuBisCo) большая субъединица, белок A реакционного центра фотосистемы II PSBA, белок B реакционного центра фотосистемы PSBB, белок C реакционного центра фотосистемы PSBC, фотосистема II PSB белок D реакционного центра, субъединица бета-АТФ-синтазы PB, альфа-субъединица АТФ-синтазы ATPF, мембранный субкомплекс ATPF-синтазы CF0, субъединица b, ATPE, АТФ-синтазный комплекс, периферическая субъединица субкомплекса CF1, эпсилон, глутамат-синтаза GLUS, фотосистема I PSAA, субъединица I, фотосистема I, PSAB субъединица B, фотосинтетический перенос электронов PETA, протеом 14 большой субъединицы пластидной рибосомы RPL14, протеом 22 большой субъединицы пластидной рибосомы RPL22, фосфоглицераткиназа 1 PGK1, транскетолаза 1 TKL1, геномы GUN5, несвязанный 5-альд-HpolB-фруктоза 1, комплекс L-бис-альд-H-фосфоктоза 1 FBA1-фруктоза FBA1 фотосистемы II 5, LHCB4 светособирающий комплекс хлорофилл-белок I субъединица A4

Группировка смещения ранга d ata по функциональным категориям показывает сегрегацию метаболизма по суточному циклу (рис. 4c).Категория фотосинтеза сместилась больше всего в рейтинге дневных переводов, переместив в общей сложности 925 позиций между ее членами. Категории синтеза белка и метаболизма аминокислот также предпочтительно транслировались в течение дня, в то время как деградация белка, модификация и клеточное дыхание предпочтительно транслировались ночью. Мы исследовали, по-разному ли влияет дневной цикл на трансляцию, происходящую в пластиде, по сравнению с цитозольной трансляцией. Для этого мы сравнили соотношение день: ночь скорости трансляции пластидных белков, кодируемых в ядре, и белков, кодируемых в пластидном геноме (рис. 4d).Было обнаружено, что трансляция на пластидных рибосомах происходит пропорционально медленнее, чем цитозольная трансляция в ночное время. Чтобы определить, был ли этот эффект специфическим для пластидной рибосомы или для самой пластиды, мы сравнили соотношение скоростей трансляции днем ​​и ночью по органеллярной локализации и аппарату трансляции (Hooper et al. 2014) (Figure 4e). В большинстве категорий соотношение день / ночь составляло от одного до двух, причем только белки, транслируемые в пластиде, и белки, локализованные в ядре, не соответствовали этим отношениям.С точки зрения стоимости АТФ на розетку, пластидные транслируемые белки имеют гораздо более высокую стоимость — ~ 6 мкМ моль АТФ по сравнению с <0,05 мкл моль АТФ для измеренных ядерных белков. Когда дневная и ночная стоимость АТФ кодируемых пластид белков рассматривается по отдельности, субъединицы реакционного центра фотосистемы II выделяются тем, что имеют гораздо большее снижение стоимости АТФ в ночное время (рис. 4f).

В попытке различить другие белки, скорость трансляции которых контролировалась сверх наблюдаемых глобальных сдвигов в скоростях трансляции, мы нормализовали медианное значение K _s для трех дневных и ночных повторов.Устанавливая одинаковое значение медианы K _s для дня и ночи, белки с существенно разными K _s можно рассматривать как подлежащие специфической регуляции трансляции сверх механизмов, которые влияют на глобальную скорость трансляции. Тест Стьюдента показал, что 75 из 143 белков, которые присутствовали во всех шести повторах (три дня, три ночи), имели значительно разные средние значения при p <0,05. После многократной тестовой коррекции (Benjamini and Hochberg 1995) 30 были ниже скорректированного p <0.05, чтобы предложить доказательства конкретной трансляционной регуляции как фактора, способствующего контролю дневного энергетического баланса (дополнительная таблица S3). Этот анализ снова выявил белки реакционного центра PSII и некоторые ядерные белки светособирающих комплексов, которые, как было обнаружено, имеют значительно более низкую скорость синтеза белка в ночное время. Эти белки - исключительно дорогие для синтеза и поддержания как высокие количества, так и высокие скорости разложения. Белки транслируются ночью быстрее, чем в среднем по миру, включая ряд стромальных изоформ гликолитических ферментов, которые, как было ранее продемонстрировано, играют центральную роль в обеспечении субстратов для дыхания в ночное время (Muñoz-Bertomeu et al.2009 г.).

Корреляция оценок трансляции белков

Оценки скорости трансляции белков обычно производятся путем измерения ассоциации конкретных транскриптов с одной или несколькими рибосомами или предполагается, что они хорошо коррелируют с обилием транскриптов. Поскольку измерения агрегированной трансляции по-прежнему являются сравнительно редкими данными, мы сравнили скорости трансляции белков, полученные в результате исследований загрузки полисом и изобилия мРНК, со скоростями трансляции, измеренными здесь посредством включения стабильных изотопов.Мы определили три исследования, посвященных суточным циклам, которые оценивали либо полисомную нагрузку, либо обилие транскриптов в дневном / ночном цикле. Первое исследование количественно сравнивало состояние трансляции конкретных транскриптов путем вычисления взвешенной суммы содержания транскрипта в полисомальных фракциях по сравнению с неполисомальной фракцией в двух временных точках на свету и двух в темноте в цикле 16 часов света / 8 часов темноты ( Missra et al.2015). Поскольку в этом исследовании используется другая продолжительность дня по сравнению с нашим, мы также включили данные о численности расшифровки из 12-часового дневного / 12-часового исследования ночи, проведенного Bläsing et al.и меньший набор данных о полисомной нагрузке, сфокусированный на ферментах центрального углеродного метаболизма в цикле 12 часов света / 12 часов темноты, проведенный Piques et al. (Bläsing et al. 2005; Piques et al. 2009).

Missra et al. (2015) получили скорость синтеза белка, моделируя суточные вариации количества транскриптов и состояния трансляции как синусоидальные волны перед их умножением. Поскольку обработанные данные не были доступны, мы создали простой эквивалент, вычислив площадь от точки к точке под кривыми для дневного и ночного количества транскриптов и состояния перевода, и умножили их вместе, чтобы получить оценку совокупного перевода.Сравнение этих соотношений показало, что вариация в полисомной загрузке всех транскриптов циклически изменяется в гораздо меньшей степени, чем можно предположить при агрегированной трансляции (Рисунок S2a). Расширение сравнения с исследованиями, которые проводились при той же продолжительности дня, дало лучшие корреляции, но величина смены дня и ночи на велосипеде постоянно недооценивалась. Измерения обилия транскриптов, проведенные Blasing et al. показали небольшую положительную взаимосвязь (рис. S2b), но только исследование 2009 г., проведенное Пиксом и его коллегами, в котором использовалась QRT-ПЦР для количественной оценки транскриптов, связанных с полисомами для выбранного диапазона центральных углеродных метаболических ферментов, показало сильную положительную взаимосвязь с агрегатом, производным от ² H трансляционные измерения (рисунок S2c).Хотя низкие корреляции могут частично объясняться различиями между лабораториями и экспериментальными установками, метаболические изменения между днем ​​и ночью не являются тонкими, и можно разумно ожидать явной положительной корреляции между полными наборами данных.

Обсуждение

В этом исследовании мы измерили уровень синтеза и разложения белка днем ​​и ночью для каждого из нескольких сотен белков. Мы отслеживали синтез и деградацию путем включения ² H во вновь синтезированный белок, одновременно отслеживая скорость деградации ранее существовавшего немеченого пула.Эти данные отличаются от предыдущих исследований, поскольку они обеспечивают прямую меру совокупного трансляционного выхода, а не косвенную оценку ассоциации рибосом, поэтому в измерения включается как глобальная, так и специфическая для транскриптов регуляция. В этих данных также используется изотоп, который в изобилии присутствует в пептидах и быстро ассимилируется в аминокислоты независимо от связывания углерода или ассимиляции азота. Этот подход позволил сократить время маркировки для измерений, специфичных для белков, чем это было возможно ранее.Измерения совокупной трансляции позволяют выявить комбинированные эффекты регуляции, происходящие на генетическом, транскрипционном и трансляционном уровнях, и не полагаются на ряд допущений, сделанных при вычислении и сообщении основанных на РНК прокси для трансляции. Таким образом, этот подход обеспечивает иную перспективу по сравнению с той, которая создается посредством статических измерений количества транскриптов и белков.

Трансляция и деградация белков листа строго регулируются в дневное время

Предыдущие исследования показали, что скорость синтеза белка на уровне всего пула в листьях растений выше в дневные часы.Этот эффект ускоряет использование крахмала, позволяя растениям избегать углеродного голодания в конце ночи (Sulpice et al. 2014) и задерживать рост на следующий день (Gibon, Bläsing, et al. 2004). Высокая корреляция Спирмена в рейтинге скорости перевода между днем ​​и ночью, с общими более низкими показателями в ночное время, хорошо согласуется с понятием общего регулирования перевода, которое способствует переводу днем ​​и подавляет его ночью (OLeary et al.2020; Merchante et al. 2017; Мур и др., 2016). Это также отражается в том, что большая часть измеренных здесь белков (~ 60%) перемещается менее чем на 30 рангов в порядке трансляции между днем ​​и ночью (дополнительная таблица S2).

Конкретные примеры регуляции трансляции

Чтобы объяснить оставшееся разнообразие наблюдаемых соотношений скоростей трансляции день: ночь (рис. 2), необходимо активировать механизмы модификации скорости, специфичные для гена или регулона (Muench, Zhang, and Dahodwala 2012) . Приблизительно 50% оцененных белков продемонстрировали свидетельства специфической регуляции трансляции, о чем судили по их средней скорости трансляции, которая значительно различалась после уравнивания средних дневных и ночных скоростей трансляции.Мы попытались оценить относительную важность общей и специфической регуляции трансляции в поддержании дневного энергетического баланса, сравнив общую стоимость АТФ в течение 24-часового цикла, потребляемого для поддержания белков, которые, по-видимому, регулируются общими механизмами контроля трансляции (89 из 143 белков. , 2,8 мкмоль АТФ / розетка) по сравнению с теми, которые сдвигают скорость трансляции значительно больше, чем медианное значение (54 из 143, 8,9 мкмоль АТФ / розетка). Большая разница в стоимости синтеза АТФ специально регулируемого набора отражает состав этого пула; пропорционально более высокая численность, быстро оборачивающиеся белки; тщательное регулирование которых может способствовать вегетативной и репродуктивной пригодности.

На вершине этого списка дорогостоящих АТФ белки с суточной регуляцией находятся в центре реакции PHOTOSYSTEM II. Субъединица D1 PSBA и ее тщательно регулируемая трансляция, деградация и сборка хорошо изучены (Anoman et al. 2016; Kato et al. 2015; Adir et al. 2003; Hutchison et al. 1996). Между PSBA, PSBB, PSBC и PSBD примерно 4,9 мкмоль АТФ на розетку используется в синтезе и разложении в течение дня, тогда как 0,87 мкмоль АТФ на розетку используется ночью.По сравнению с общими затратами на синтез и деградацию — 15,1 мкмоль в день и 6,9 мкмоль за ночь, конкретное снижение синтеза и деградации этих четырех белков составляет примерно половину разницы в затратах на трансляцию и деградацию белков, что делает их специфический контроль значительным вкладом в снижение затрат на содержание протеина в ночное время.

Селективная регуляция трансляции светособирающих белков также изучалась ранее. Трансляция этих белков происходит в цитоплазме, но регулируется в ответ на фотосинтетический поток (Petracek et al.1997), а также свет (Флорис и др., 2013). Как показано на примере других видов, отдельные члены также специфически регулируются трансляцией; LHCBM специфически регулируется в ответ на переходы от слабого освещения к яркому (McKim and Durnford 2006) по сравнению с LHCB4 у C. reinhardtii . Эта регуляция механистически объясняется действием NAB1, цитозольного РНК-связывающего белка, который избирательно взаимодействует с транскриптами LHCBM и изолирует их от трансляционного аппарата (Mussgnug et al.2005). Наши данные показывают, что этот феномен очевиден в совокупных данных скорости трансляции, но не очевиден в данных ассоциации мРНК (рисунок S2a). Открытие того, что до 50% белков, скорости трансляции которых были измерены здесь, демонстрируют свидетельства специфической регуляции трансляции, предполагает, что такие механизмы могут быть более широко распространенными, чем это считается в настоящее время.

Приведенные выше примеры иллюстрируют белки, которые ночью транслируются медленнее, чем можно предположить по средним показателям. Однако локализованные в пластидах гликолитические ферменты демонстрируют противоположную тенденцию: скорость трансляции в ночное время значительно выше, чем в среднем.Все пластидные изоформы ФРУКТОЗ-1,6-БИСФОСФАТАЗЫ, ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА А-2 и ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАЗА показывают более высокие скорости трансляции ночью, чем можно было бы ожидать. Оказалось, что важность пластидного гликолиза в расщеплении крахмала трудно оценить из-за присутствия переносчиков, способных обменивать гликолитические промежуточные продукты с цитозолем. Эти переносчики ограничивают применимость нокаутированных растений для оценки относительной важности цитозольных и локализованных в пластиде изоформ гликолитических ферментов.Идентификация фенотипов нокаутов изоформ, локализованных в пластидах, в специфически гетеротрофных тканях (Anoman et al. 2016) предполагает, что эти ферменты играют важную роль в обеспечении нефотосинтетической энергии в некоторых тканях. Наблюдение здесь, что их скорость трансляции в ночное время была специально увеличена, подтверждает более широкую роль в обеспечении энергии в ночное время в фотосинтетических тканях.

Селективные изменения суточной скорости деградации белка изучены несколько меньше.Регуляторы циркадных часов специфически расщепляются протеасомой в соответствии с заданными по времени образцами с использованием комбинации фосфорилирования и активации убиквитинлигазы E3 в растениях (Fujiwara et al. 2008; Harmon, Imaizumi, and Gray 2008; Ooijen et al. 2011). Существует мало доказательств наличия у растений избирательных механизмов суточной деградации, помимо основных или периферических часовых компонентов, хотя большое количество лигаз E3 связано с их селективными субстратами в растениях, и многие из них проявляют реакцию на развитие или стресс (Vierstra 2009; Shu and Yang 2017) .Более широкие исследования печени мышей показали, что ежедневные колебания макро- и шаперон-опосредованной аутофагии и протеасомной активности эффективно концентрируют протеолиз печени в течение дня (Рыжиков и др., 2019). Насколько нам известно, нам не хватает доказательств того, как селективная суточная трансляция и деградация одних и тех же компонентов связаны, чтобы генерировать гомеостаз, наблюдаемый в изобилии белка (Рисунок 2b). Протеом стояния листа модулируется только при гораздо более длительных переходах к средам с коротким и длинным днем, и то в большинстве случаев это происходит лишь в умеренной степени (Seaton et al.2018).

Дивергенция количества транскриптов и скоростей трансляции в течение суточного цикла

Хотя существует множество глобальных отчетов о суточных вариациях в ассоциации полисом и анализе Riboseq (Bläsing et al. 2005; Missra et al. 2015), мы отметили, что в целом низкая корреляция между этими изменениями и совокупными ставками переводов. В частности, разница на порядок в диапазоне этих показателей ассоциации транскриптов рибосом и различий в скорости трансляции белков (рисунок S2, дополнительная таблица S1).Мы предполагаем, что примирение может происходить из признания того, что измеряются разные вещи. Когда были измерены как загрузка полисом, так и трансляционный выход, наблюдались значительные расхождения. Например, Pal et.al. показали, что в то время как нагрузка полисомов ночью составляла примерно 2/3 от дневной, результирующая трансляция составляла только 1/3 скорости, наблюдаемой в дневные часы (Pal et al. 2013).

Полисомный статус транскрипта (сколько рибосом связано с конкретным транскриптом) — это общий показатель для трансляции любого транскрипта, основанный на концепции, согласно которой, чем больше рибосом связывается с транскриптом, тем быстрее увеличивается скорость его трансляции.Riboseq улучшает этот метод, дифференцируя активно транслируемые рибосомы от приостановленных рибосом (Calviello and Ohler, 2017). Однако оба эти метода представляют собой статические снимки «входа» рибосомы. Между этим исходным измерением и прямым измерением трансляции лежит ряд допущений. В частности, скорость инициации трансляции ограничивает скорость и что скорость удлинения полипептидной цепи постоянна для всех транскриптов. Регуляторные механизмы, такие как использование кодонов, ингибирование субстрата трансляции, взаимодействия выходного туннеля рибосом и вторичные структуры мРНК, могут быть плохо учтены, когда предполагаются скорости трансляции (Merchante, Stepanova, and Alonso, 2017).Напротив, количественное определение совокупного преобразования, описанное в этом отчете, обеспечивает сопоставление всех входных данных и ограничений обработки, чтобы обеспечить эффективный суммарный выход рибосомы.

Трансляция белка коррелирует с потоком пути

В то время как изобилие белка в основном не изменяется для основного метаболического и биосинтетического аппарата листа в течение суточного цикла (рис. 3b), скорость трансляции, по-видимому, частично коррелирует с потоком через метаболические пути.Например, сильная трансляция в дневное время механизмов фотосинтеза и синтеза аминокислот, а также самого механизма синтеза белка, связана с высокими скоростями всех трех этих процессов на свету. В то время как некоторые из этих механизмов кодируются пластидами, и, следовательно, на скорость их синтеза будет влиять отсутствие синтеза АТФ хлоропластов в темноте, большее их количество кодируется ядром и зависит от цитозольного пула АТФ и механизмов трансляции. Хотя эта корреляция может быть связана исключительно с регулируемым использованием АТФ, когда он более доступен в свете, возможно, что процессы регулирования жестко закрепили биофизическую связь между использованием и потребностью в замене.Конкретный случай субъединицы D1 PSII является примером этого эффекта с повреждением и необходимостью замены, связанными с каталитическим механизмом и 11-кратной разницей в скорости оборота, наблюдаемой здесь (дополнительная таблица S1). Однако этот эффект может быть шире, мы недавно выделили концепцию каталитических циклов до замещения, которая является свойством ферментов из-за метаболических взаимодействий и повреждений во время работы (Tivendale et al.2020). Таким образом, большое количество каталитических циклов на свету для некоторых ферментов потребует более быстрого графика замены на свету, чтобы поддерживать пулы ферментов на максимальной ферментативной способности.Когда максимальная экстрагированная активность 24 таких ферментов была измерена в течение суточных циклов (Гибон и др., 2004), было обнаружено, что многие из них падали в максимальной активности в первые несколько часов утра и повышались в течение дня, а затем снова падали в течение дня. ночь. Часто> 1,5-кратные суточные вариации этих сообщаемых активностей ферментов (Гибон и др., 2004) не проявляются в изменениях обилия белка, предполагая, что комбинация активации и дезактивации ферментов частично ответственна, и это, вероятно, является комбинацией посттрансляционные модификации ферментов и поврежденные ферменты, ожидающие замены.

Заключение

В соответствии с недавним акцентом на разработке новых высокопроизводительных подходов к картированию и количественной оценке различных критических параметров, влияющих на исходные данные трансляции, таких как структура РНК, взаимодействия белок-РНК и занятость рибосом на уровне генома (Merchante 2017) , также оправдан новый энтузиазм в изучении результатов перевода. Здесь мы усиливаем потенциал для мечения растений ² H, чтобы внести свой вклад в этот процесс. Более подробно мы выделяем ряд компонентов, для которых входные и выходные показатели трансляции заметно различаются, указывая на селективные события регуляции трансляции, которые в настоящее время скрыты от просмотра.В обзоре мы показываем, как совокупный характер этих данных позволяет понять, насколько ограниченные энергетические ресурсы являются приоритетными для оптимизации метаболизма и молекулярной пригодности во время дневных и ночных циклов листьев.

Материалы и методы

Условия роста растений

Семена Arabidopsis thaliana Col-0 высевали на 0,8% агар / ddH ₂ O (мас. / Об.), Содержащиеся в 2 мл крышках пробирок Эппендорфа с отверстиями диаметром ~ 3 мм. Затем крышки помещали в 24 штативы для пробирок и яровизировали перед переводом на 12/12 часовой дневной (220 мкмоль / м ² / секунда белый свет) ночной цикл при постоянной 22 ° C.Среда Хогланда крепостью 0,5 использовалась на всем протяжении, растворы менялись еженедельно. Реагенты, включающие тяжелые изотопы, были приобретены у Sigma 5% ² H _{2 Растворы с добавлением} O были составлены об / об из 99,9% оксида дейтерия, в то время как растворы ¹⁵ N содержали K ¹⁵ NO ₃ 98% и ¹⁵ NH ₄ ¹⁵ NO ₃ 98% получено от Sigma Aldrich.

Подготовка и анализ образцов

Образцы готовили, как описано ранее (Duncan et al.2017). Ресуспендированные пептиды фракционировали на 96 образцов с помощью обращенно-фазовой хроматографии с высоким pH (Wang et al.2011) перед объединением в 12, каждый из которых анализировали в течение 90 минут (2-27% ацетонитрила) на Thermo Fisher Orbitrap Fusion с 75 мкм x Колонка EASY-Spray c18 диаметром 500 мм, управляемая системой Dionex UltiMate 3000 RSLCnano. Исходные файлы были преобразованы в формат * .mzML (MSConvert, ProteoWizard 3.0.20079) и сопоставлены с пептидными последовательностями Araport11 (www.arabidopsis.org) с помощью CometMS (2019.01 ред. 5) (Eng, Jahan, and Hoopmann, 2013). Результаты были пересмотрены, и списки белков составлены с помощью PeptideProphet (Keller et al. 2002) и ProteinProphet (Несвижский и др. 2003) (Trans-Proteomic Pipeline v5.0.0). Списки функций MS ¹ были собраны с помощью Dinosaur (1.1.0) (Teleman et al., 2016), а результаты вставлены в базы данных PostgreSQL с помощью MSFTBX (Автономов, Раскинд и Несвижский, 2016). Идентификации пептидов были сопоставлены с функциями MS ¹ в среде R для статистических вычислений (R Core Team, n.d.) и время удерживания, согласованное с помощью сглаживания локально оцененного графика рассеяния (LOESS). Файлы первичных данных масс-спектрометрии доступны через ProteomeXchange с идентификатором PXD023274.

Прогрессивный анализ включения изотопов

Для приблизительно 120000 идентификаций пептидов на образец был собран профиль одного изотопа путем извлечения десяти ионных хроматографов — от моно до плюс 9 тяжелых с +/- 2 секунды вокруг максимального значения моноизотопного пика и суммирования интенсивности в этом диапазоне с использованием XCMS (Smith et al.2006 г.). В случае образцов, меченных ² H, ₂ O, поправочный коэффициент для времени удерживания меченых пиков из-за модификации гидрофобности, вызванной включением ² H, был вычислен на подмножестве данных высокого качества, но оказался пренебрежимо мало из-за низкого уровня включения, наблюдаемого здесь. Данные относительного включения изотопов, называемые фракцией меченых пептидов, были рассчитаны, как подробно описано ранее (Nelson et al., 2014), и обновлены (Li et al., 2017) с модификациями, подробно описанными ниже.Данные были отфильтрованы, требуя, чтобы корреляция между изотопной огибающей, извлеченной из немаркированного образца, с расчетной огибающей естественной численности была больше 0,97, максимум интенсивности связанной характеристики MS ¹ был больше 50 000, чтобы отклонение Результат NNLS был менее 0,009, ошибки моноизотопной массы были равны нулю, а самая тяжелая популяция NNLS была менее 3%. Список белковых групп был составлен путем анализа всех немеченых прогонов как одного образца, что позволило согласованно отнести пептиды к белковым группам на протяжении всего эксперимента.Данные, которые соответствовали указанным выше критериям, были упорядочены по сумме интенсивностей признака MS ¹ , и средняя фракция меченого пептида была получена из всех доступных измерений трех верхних пептидов с различной последовательностью для каждой группы белков. Эта сборка выполнялась как для каждой реплики, так и для общего набора данных, в котором были объединены данные из всех реплик. Каждая группа белков имела как минимум 3 различные пептидные последовательности и как минимум 5 независимых измерений меченой пептидной фракции, которые должны быть включены в общий набор данных, или 3 различные пептидные последовательности с как минимум 3 независимыми измерениями, которые должны быть включены в отдельный анализ репликации.Каждая группа белков имела в среднем 8,84 независимых измерения 3,9 различных пептидных последовательностей в общем наборе данных и 3 различных пептидных последовательности с 3 независимыми измерениями в анализе повторений. Было рассчитано стандартное отклонение и относительное стандартное отклонение для каждой группы белков в обеих сборках, и группы с RSD <0,25 или SD <0,06 были оставлены для анализа.

Относительный количественный анализ

Образцы были взяты от растений, выращиваемых параллельно как в немеченой среде, так и в среде ¹⁵ N.В случае образцов растений, меченных ¹⁵ N, отбирали образцы в конце ночи и в конце дня перед их смешиванием в соотношении 1: 1 в пересчете на свежий вес перед экстракцией белка. Немеченые растения отбирали в конце ночи и в конце дня, и экстракцию белка проводили отдельно. Немеченые образцы были смешаны в соотношении 1: 1 с меченой белковой смесью (амидо-черный) перед перевариванием. Определение отношения меченой численности к немаркированной было выполнено, как указано выше, со следующими модификациями — корреляция диапазона естественной численности с теоретической не использовалась для фильтрации данных, а среднее отношение естественной численности к численности было нормализовано к 0.5 на реплику.

Анализ площади листа

Горшки, содержащие 24 растения, выращивали на сетке 3×3, как указано выше, фотографировали ежечасно, запуская Cannon EOS600D с Aputure AP-TR1C. Каждый горшок из 24 растений был выровнен по сетке 3 x 3, и изображения были обработаны путем разделения на 9 с использованием функций кадрирования и повторения Imagemagick (команда разработчиков ImageMagick 2020) и общего количества зеленых пикселей (210,210,20 rgb) на изображение, подсчитанного с использованием 15 % фактор нечеткости.

Сноска о распространении материалов

Автор несет ответственность за распространение материалов, составляющих выводы, представленные в этой статье, в соответствии с политикой, описанной в Инструкциях для авторов (www.plantcell.org): А. Харви Миллар (harvey.millar {at} uwa.edu.au)

Дополнительные данные

Рисунок S1. Измерения относительной площади листьев растений, выращенных с использованием 5% и без него в течение 12 часов ² H ₂ O.

Рисунок S2. Сравнение регуляции совокупной скорости синтеза белка с суточным уровнем транскрипта и полисомальной занятости.

Таблица S1. Сводная таблица скорости синтеза и разложения белка в листьях арабидопсиса в ночное и дневное время

Таблица S2.Сводная таблица изменений скорости синтеза белка от ночи к дню в листьях Arabidopsis

Таблица S3. Сводка данных о скорости синтеза белка в ночное и дневное время в листьях арабидопсиса после медианной нормализации реплик

Вклад авторов

OD и AHM разработали исследование. OD проводил эксперименты и анализ данных, OD и AHM написали статью.

Благодарности

Эта работа поддержана наградами Австралийского исследовательского совета CE140100008 и DP180104136 (А.Х.М.). Анализ для этой работы был выполнен организацией WA Proteomics Facility как узлом Proteomics Australia при финансовой поддержке инфраструктуры со стороны правительства штата Западной Австралии в партнерстве с Bioplatforms Australia в рамках национальной стратегии развития инфраструктуры совместных исследований правительства Содружества.

Роль фактора элонгации синтеза белка EF-Tu в термостойкости растений

EF-Tu белков пластид, митохондрий и цитозольного аналога EF-1 α в растениях, а также белков EF-Tu бактерий, очень консервативны и многофункциональны.Функции EF-Tu включают транспортировку комплекса аминоацил-тРНК к сайту А рибосомы во время биосинтеза белка; активность шаперона в защите других белков от агрегации, вызванной стрессами окружающей среды, облегчая ренатурацию белков, когда условия возвращаются к нормальным; проявление активности протеиндисульфидизомеразы; участие в расщеплении протеасомами белков, блокированных на N-конце; вызывание врожденного иммунитета и запуск устойчивости растений к патогенным бактериям; участвует в транскрипции, когда E.coli инфицирован фагами. Гены EF-Tu активируются абиотическими стрессами у растений, и EF-Tu играет важную роль в ответных реакциях на стресс. Экспрессия гена EF-Tu растения придает термостойкость в E. coli , нокаутированные мутанты EF-Tu кукурузы чувствительны к теплу, а сверхэкспрессия гена EF-Tu улучшает термостойкость культурных растений. В этом обзоре суммируются текущие знания о белках EF-Tu в ответах на стресс у растений и о прогрессе в применении EF-Tu для создания сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к абиотическим стрессам, таким как высокие температуры.

1. Введение

Фактор элонгации синтеза белка Tu (EF-Tu) — это белок, который играет центральную роль в фазе элонгации синтеза белка в бактериях и органеллах, включая митохондрии и пластиды растений (рис. 1). Цитозольный гомолог EF-Tu у растений — EF-1 α . Цикл элонгации полипептида состоит из трех этапов: (1) EF-Tu связывает GTP и аминоацил-тРНК, что приводит к кодон-зависимому размещению этой аминоацил-тРНК в сайте A рибосомы, гидролизу GTP и высвобождению EF. -Tu-GDP из рибосомы; (2) EF-Ts (коэффициент удлинения Ts) способствует обмену связанного EF-Tu GDP на GTP; (3) при образовании пептидной связи EF-G (фактор элонгации G) перемещает мРНК на один кодон, чтобы обеспечить прибытие новой аминоацил-тРНК в сайт A [1].EF-Tu и EF-Ts были впервые выделены как компоненты так называемого фактора T (перенос) и обозначены как термоустойчивые (Tu) и термостабильные (Ts) фракции [2] соответственно. Это сравнение термостабильности вызывает сомнения, потому что позже было доказано, что EF-Tu выдерживает высокотемпературные обработки [3, 4], особенно в комплексе с нуклеотидными факторами, GTP или GDP [5].