Клубеньковые бактерии живут на корнях растений: Клубеньковые бактерии живут и размножаются в клетках корней растений

Введение

Синтезированные в рибосомах пептиды с биологическими функциями произвольно (и нечетко) определены как кодируемые генами небольшие белки от 2 до около 100 аминокислот. Исследования пептид-опосредованных сигнальных процессов и других пептидных функций у растений набирают силу в последнее десятилетие [обзор см. В Tavormina et al. (2015)]. Критическое значение пептидов было продемонстрировано в эмбриогенезе (Costa et al., 2014), оплодотворение (Okuda et al., 2009; Higashiyama, 2010; Mecchia et al., 2017; Ge et al., 2017), экспансия клеток (Haruta et al., 2014; Murphy and De Smet, 2014), дифференцировка клеток (Бутенко и др., 2003; Хант и др., 2009; Мацузаки и др., 2010; Сугано и др., 2010; Ли и др., 2015; Сантьяго и др., 2016; Доблас и др., 2017; Nakayama et al., 2017), иммунитет (Constabel et al., 1995; Pearce et al., 2001; Huffaker et al., 2006; Hou et al., 2014; Stegmann et al., 2017), питание ( Табата и соавт.2014; Ohkubo et al., 2017), а также в других процессах (Whitford et al., 2012; Takahashi et al., 2018). Поле симбиоза Rhizobium — не отстает, когда дело доходит до открытий пептидов, играющих ключевую роль в процессе нодуляции (Djordjevic et al., 2015). В этом обзоре мы суммируем эти пептидные сигналы и пептидные эффекторы и имеющиеся знания об их идентифицированных или прогнозируемых функциях в симбиозе (рис. 1).

РИСУНОК 1. Пептиды, способствующие образованию клубеньков. Левая часть рисунка представляет собой узелковое растение M. truncatula . На вставке показано увеличенное изображение узелков. Верхние изображения показывают срез зачатка клубенька, показывающий сеть инфекционных нитей, окрашенных в синий цвет (слева) , и симбиотическую клетку клубенька, плотно упакованную дифференцированными бактериоидами (справа) . Нижнее изображение представляет собой часть зрелого клубенька, на котором зеленым цветом виден ризобия. Красное окрашивание показывает ядра растительных клеток, выделяя в основном меристему клубенька.Пептиды, участвующие в нодуляции, указаны в предполагаемом месте их действия. Пептиды CLE продуцируются в ответ на уже инициированные узелки или с высоким содержанием нитратов. Они являются системными сигналами, полученными в побеге рецептор-подобными киназами HAR1 / SUNN / NARK, которые, в свою очередь, производят полученный из побега сигнал, который ингибирует дальнейшую нодуляцию в корнях. Пептиды CEP, с другой стороны, продуцируются в корнях, и их продуцирование усиливается низким содержанием азота. Пептиды воспринимаются CRA2-рецептор-подобной киназой и стимулируют нодуляцию через системный механизм.Пептиды RALF и DLV негативно влияют на процесс инфекции на ранних стадиях развития клубеньков. На более поздних стадиях RALF имеет негатив, в то время как PSK оказывает положительное влияние на процесс. ENOD40 и miPEP172c влияют на образование зачатка клубенька. uORFp1 участвует в управлении содержанием меристемы. Пептиды NCR и потенциально также пептиды GRP и SNARP контролируют дифференцировку и функционирование бактериоидов.

В ответ на азотное голодание растения семейства Leguminosae могут установить симбиоз со своими партнерами Rhizobium , что приводит к развитию корневых клубеньков и внутри клеток клубеньковых растений, превращению бактерий в азотфиксирующие бактероиды.Для инициации симбиоза и поиска соответствующей бактерии Rhizobium в почве растения бобовых культур выделяют из своих корней флавоноиды и изофлавоноиды, действующие как индукторы генов нодуляции в их симбионте. Активация генов нодуляции приводит к образованию бактериальных сигнальных молекул, факторов Nod, которые вызывают органогенез клубеньков в растении-хозяине и необходимы также для процесса инфекции. Уже на этой стадии несколько растительных пептидов влияют на восприимчивость растения к инфекции и нодуляции и участвуют в регуляции этих первых стадий развития и дифференцировки.Кроме того, завод инвестирует только в количество конкреций, необходимых для удовлетворения потребностей в азоте. Числа клубеньков отрицательно контролируются ауторегуляцией нодуляции и высоким содержанием нитратов с использованием пептидов, связанных с CLV3 / ESR (CLE), которые оказывают системное отрицательное регулирование на нодуляцию посредством передачи сигналов от корней и побегов . Члены семейства CEP-кодируемых пептидов (CEP), напротив, оказывают положительное влияние на нодуляцию в ответ на низкую доступность азота.

Хотя эти пептидные сигналы играют общие и консервативные роли, и некоторые из их членов также были набраны для участия в азотфиксирующем симбиозе, другие большие секретируемые семейства симбиотических пептидов, которые специфически развивались в определенных линиях бобовых, связаны с необратимыми или терминальными, дифференциация бактероидов.Эти бактероиды не способны переключаться из симбиотического состояния в свободное живое и поэтому не пригодны для культивирования. Они также морфологически отличаются от свободноживущих клеток, часто демонстрируя значительный рост и изменение формы клеток, имея усиленный геном и измененную клеточную оболочку с повышенной проницаемостью мембраны. Такая терминальная бактериоидная дифференциация встречается в нескольких, но не во всех ветвях семейства Leguminosae, и до настоящего времени изучалась только у бобовых культур Inverted Repeat Lacking Clade (IRLC) из подсемейства Papilionoideae и в филогенетически отдаленном Aeschynomene роду Dalbergoid. бобовые культуры.У этих бобовых эти пептиды направляют терминальную дифференцировку бактериоидов, что необходимо для азотфиксации. В других бобовых, где судьба бактероидов обратима и эндосимбионты могут вернуться к свободноживущей жизни, нет никаких изменений в морфологии, размере, содержании ДНК и мембранных свойствах бактерий, и этим бобам не хватает генов, кодирующих Вышеупомянутые симбиотические пептидные семейства в их геноме. Подавляющее большинство этих пептидов являются специфичными для клубеньков пептидами, обогащенными цистеином (NCR), но существуют также пептиды, богатые глицином (GRP), а также небольшие нодулиновые кислые РНК-связывающие пептиды (SNARPs или также называемые LEED)..PEED в соответствии с консервативным аминокислотным мотивом).

Растительные пептиды, вовлеченные в инфекцию и органогенез клубеньков

регуляторов, кодируемых генами пептидного кодирования

Семейство факторов быстрой алканизации (RALF)

Ген Medicago truncatula MtRALFL1 был идентифицирован на скрининге транскриптома для ранних генов, индуцированных Nod-фактором, с использованием двойной супернодулирующей мутантной линии (Combier et al., 2008b). Ген кодирует члена семейства RALF, богатого цистеином и секретируемого пептида, которое включает 15 членов в М.truncatula (Silverstein et al., 2007; de Bang et al., 2017). Известно, что в растениях пептиды семейства RALF контролируют иммунитет, а также рост клеток, особенно при росте корневых волосков и пыльцевых трубок (Murphy and De Smet, 2014; Haruta et al., 2014; Ge et al., 2017; Mecchia et al. al., 2017; Stegmann et al., 2017). Секреция пептидов RALF указывает на то, что они функционируют в передаче сигналов от клетки к клетке, что они действительно делают через взаимодействие с рецепторами, расположенными на клеточной мембране, такими как рецептор-подобная киназа FERONIA.Примечательно, что FERONIA и другие RALF-связывающие рецепторы являются родственными рецептор-подобными киназами, которые имеют эктодомен (лиганд-связывающий внеклеточный домен рецептора), состоящий из двух малектиноподобных доменов (Li et al., 2016). Пептиды RALF связаны малектинсодержащими эктодоменами, но молекулярные детали взаимодействия требуют дальнейшего уточнения.

Ген MtRALFL1 индуцируется обработкой Nod-фактором корней M. truncatula , хотя эта индукция наблюдалась только на определенном генетическом фоне супернатулирующего серпа сунн-2 серпа (Combier et al., 2008b). Эта линия M. truncatula обладает более высокой чувствительностью к факторам Nod и, следовательно, позволяет обнаруживать ответы, которые не видны на фоне дикого типа. Участие пептида MtRALFL1 в нодуляции было дополнительно подтверждено сверхэкспрессией MtRALFL1 в трансгенных корнях M. truncatula , что привело к резкому снижению числа клубеньков и аномально большому количеству абортированных инфекционных потоков. Более того, несколько узелков, инициированных на трансгенных корнях, не развивались в зрелые азотфиксирующие органы.Таким образом, MtRALFL1 контролирует образование нитей инфекции и, возможно, другие стадии развития узелков (Combier et al., 2008b). Интересно, что нити инфекции имеют полярный режим роста, подобный корневым волоскам и пыльцевым трубкам, на рост которых также влияют пептиды RALF у других видов растений. Кроме того, рецептор-подобная киназа NORK [также известная как «не вызывает инфекций 2» (DMI2) или «рецептор-подобная киназа симбиоза» (SymRK)], является частью комплекса рецепторов Nod-фактора, регулирующего формирование инфекционной нити. содержит в своем эктодомене малектиноподобный домен (Endre et al.2002; Antolín-Llovera et al., 2014). Хотя общая структура эктодомена NORK отличается от эктодомена FERONIA и связанных с ним рецептор-подобных киназ наличием дополнительного богатого лейцином повторного домена, заманчиво предположить, что пептид MtRALFL1 нацелен на рецепторный комплекс фактора Nod.

Medicago DEVIL (MtDVL1) Несекреторный пептид

Другой охарактеризованный регуляторный пептид в M. truncatula называется MtDVL1. Ген MtDVL1 был идентифицирован на том же экране транскриптома, что и описанный выше ген MtRALFL1 (Combier et al., 2008b). MtDVL1 гомологичен семейству пептидов ROTUNDIFOLIA FOUR (ROT4) или DEVIL (DVL) у Arabidopsis, которые консервативны у растений (Guo et al., 2015). Эти пептиды не являются секреторными и, как полагают, функционируют автономно на клетках (Ikeuchi et al., 2011). Понимание биологической функции и способа действия этого семейства пептидов ограничено. Мутанты с потерей функции или нокдауном не обнаруживают заметных фенотипов, вероятно, из-за избыточности генов в семействе, но избыточная экспрессия некоторых членов семейства у Arabidopsis приводит к фенотипам, свидетельствующим об участии пептидов DVL в развитии растений (Narita et al.2004; Вен и др., 2004; Ikeuchi et al., 2011; Вальдивия и др., 2012; Guo et al., 2015). Функцию гена MtDVL1 в симбиозе также оценивали с помощью исследований избыточной экспрессии в трансгенных корнях M. truncatula , что привело к значительному увеличению числа абортных инфекций в коре корня и, соответственно, значительному снижению формирования клубеньков, предполагая, что пептид MtDVL1 играет отрицательную регуляторную роль в нодуляции и особенно в ризобиальной инфекции (Combier et al., 2008b).

Фитосульфокин (ПСК) пептиды

Фитосульфокины представляют собой пептиды из пяти аминокислот, содержащие два сульфатированных остатка тирозина. Эти пептиды продуцируются в виде препропротеинов, которые секретируются в виде сульфатированных предшественников в клеточном апопласте, где они затем перерабатываются в пептид PSK с помощью субтилизин-сериновой протеазы (Srivastava et al., 2008; Komori et al., 2009). Пептиды PSK распознаются рецептор-подобной киназой и действуют главным образом как факторы, способствующие росту (Matsubayashi et al., 2002), но также участвуют в иммунном ответе растений путем ослабления вызванного паттерном иммунитета против биотрофов или стимулирования иммунитета против некротрофных патогенов (Igarashi et al., 2012; Zhang et al., 2018). В Lotus japonicus было идентифицировано пять генов PSK , два из которых продемонстрировали специфическую для клубеньков экспрессию, обнаруживаемую главным образом в инфицированных ризобием симбиотических клетках (Wang et al., 2015). Сверхэкспрессия одного из генов PSK в трансгенном L.корни japonicus , а также внешнее применение пептида PSK-α к корням усиливают нодуляцию. PSK. Сверхэкспрессия не увеличивала число случаев инфицирования или количество инициированных клубочковых зачатков, и, следовательно, усиленная нодуляция была приписана стимуляции роста клубеньков из зачатков PSK. Кроме того, избыточная экспрессия PSK приводила к подавлению пути трансдукции сигнала жасмоната. Таким образом, специфичные для клубеньков пептиды PSK также могут быть важны в узелках для подавления защитных реакций хозяина против ризобии (Wang et al., 2015).

коротких пептидов, кодированных sORF (sPEP)

Пептиды, описанные к настоящему времени, получены из генов, основная открытая рамка считывания которых (ORF) кодирует пептид или предшественник пептида. Недавно дополнительный источник пептидов был обнаружен в коротких ORF (sORF), расположенных в молекулах РНК, которые выполняют другую первичную функцию (Andrews and Rothnagel, 2014; Hellens et al., 2016; Makarewich and Olson, 2017). Эти РНК могут представлять собой транскрипты, ранее аннотированные как длинные некодирующие РНК (lncRNAs), первичные транскрипты микроРНК (pri-miRNAs) или мРНК, кодирующие белок.Трансляция некоторых из этих sORFs была продемонстрирована экспериментально с помощью трансляционного слияния GUS, профилирования рибосом, сверхэкспрессии или мутационного анализа транскрипта в планте или с помощью иммунологической детекции пептидов. Биологическая активность некоторых sPEPs была продемонстрирована в заявке Planta или in vitro биохимической активности. Примеры sORF / sPEP были определены как регуляторы нодуляции.

пептидов, кодируемых sORF в pri-miRNAs (miPEP)

Класс недавно идентифицированных пептидных регуляторов, открытых к настоящему времени только в растениях, кодируется генами микроРНК (miRNA).MiRNAs представляют собой 21–24 нт регуляторных молекул РНК и функционируют посредством спаривания оснований с комплементарными последовательностями в мРНК-мишенях, опосредуя расщепление или ингибирование трансляции-мишени. MiRNAs транскрибируются в виде больших pri-miRNAs, которые затем превращаются в зрелые miRNAs. Основываясь на тематических исследованиях в Arabidopsis и M. truncatula , сообщалось, что некоторые pri-miRNAs содержат в своих 5′-функциональных sORFs, кодирующих так называемые miPEP (Lauressergues et al., 2015).Доказательства для продукции Arabidopsis miPEP165a и M. truncatula miPEP171b были получены с помощью трансляционных слияний с GUS и вестерн-блоттингом и иммунолокализацией специфическими антителами, продуцированными против соответствующих синтетических пептидов. Кроме того, путем сверхэкспрессии соответствующих sORF или внешнего применения синтетических пептидов на растениях было показано, что miPEP специфически усиливают транскрипцию их родственной первичной транскрипции. Тем самым они образуют петлю положительной обратной связи и повышают уровень соответствующей микроРНК, усиливают исходный эффект и еще больше снижают экспрессию генов-мишеней микроРНК.Хотя miPEP были экспериментально охарактеризованы только в нескольких случаях, исследование последовательностей pri-miRNAs растений показывает, что они обычно содержат sORF, что позволяет предположить, что miPEP обычно кодируются pri-miRNAs.

Недавно было показано, что miPEP контролирует нодуляцию у сои (Couzigou et al., 2016). Известно, что некоторые микроРНК регулируют различные стадии процесса нодуляции [rev. Couzigou and Combier (2016)]. Одной из этих miRNAs является miR172c сои, которая нацелена на ген NNC1 , кодирующий фактор транскрипции APETALA 2.Транскрипционный фактор NNC1, который регулирует специфичный для клубеньков ген ENOD40 (см. Ниже), негативно влияет на нодуляцию, и, таким образом, экспрессия miR172c стимулирует нодуляцию за счет снижения активности NNC1 (Wang et al., 2014). Аналогично ранее охарактеризованным pri-miRNAs M. truncatula и Arabidopsis, первичный транскрипт сои miR172c кодирует miPEP172c. Интересно, что было обнаружено, что полив растений сои раствором, содержащим синтетический пептид miPEP172c, приводит к увеличению числа клубеньков.Эта усиленная нодуляция коррелировала с более высокой экспрессией первичного транскрипта miR172c и нескольких маркерных генов нодуляции, тогда как экспрессия гена NNC1 была значительно снижена (Couzigou et al., 2016).

пептидов, кодируемых вышестоящими ORF (uORF)

Регуляторные sPEP также могут кодироваться sORF, расположенными в 5′-лидерных последовательностях мРНК, кодирующих белок. Эти sORF обычно называют uORF. uORFs являются вездесущими и были идентифицированы у большинства эукариот.Почти 50% мРНК содержат uORFs (Andrews and Rothnagel, 2014; Hellens et al., 2016). Профилирование рибосом и протеомика в клетках млекопитающих и человека показали, что многие из uORF действительно транслированы, но только немногие были функционально проанализированы. Общей функцией этих охарактеризованных uORFs является ослабление трансляции их связанной нисходящей кодирующей ORF путем остановки рибосом на 5′-лидерной последовательности (Andrews and Rothnagel, 2014).

Такой uORF и его кодированный sPEP играют важную роль в поддержании меристемы узелков в M.усеченная . Транскрипционный фактор NF-YA1 у M. truncatula (также известный как MtHAP2-1) контролирует функцию меристемы клубеньков (Combier et al., 2006). Ген NF-YA1 экспрессируется в меристеме, и его профиль пространственной экспрессии тонко регулируется двумя механизмами, которые репрессируют экспрессию NF-YA1 в соседней зоне инфекции узелка (зона II). В более молодых клубеньках ген NF-YA1 негативно регулируется в зоне II микроРНК miR169 (Combier et al., 2006). У более старых узелков второй механизм принимает отрицательное регулирование в зоне II. Альтернативно сплайсированная мРНК гена NF-YA1 экспрессируется в этой зоне. Альтернативный сплайсинг первого интрона гена NF-YA1 приводит к транскрипту с длинной 5′-лидерной последовательностью, содержащей uORF, кодирующий пептид из 62 аминокислот, называемый uORF1p (Combier et al., 2008a). Трансляция этого пептида была подтверждена трансляционным слиянием uORF1p с GUS.Функциональность пептида uORF1p была исследована с помощью его сверхэкспрессии, которая снижала экспрессию гена NF-YA1 , что приводило к развитию аберрантных узелков, лишенных тканевой дифференцировки. Более того, специфическое связывание пептида uORF1p было продемонстрировано in vitro с 5′-областью транскрипта NF-YA1 . Вместе данные указывают на то, что синтез пептида uORFp1 в зоне II снижает в транс уровни мРНК его родственного гена NF-YA1 и, таким образом, в комбинации с miR169 он ограничивает экспрессию гена в узелке меристемы.Интересно, что этот in- trans- механизм действия пептида uORFp1 на уровни мРНК является уникальным, потому что другие описанные uORFs действуют на cis и ингибируют трансляцию нижестоящей ORF при остановке рибосомы (Andrews and Rothnagel, 2014) ,

короткий пептид раннего нодулина ENOD40

sORF также присутствуют в РНК, аннотированных как lncRNAs, которые являются транскриптами, которые не кодируют более длинный белок. В большинстве случаев трудно предсказать значение sORFs в этих lncRNAs (Andrews and Rothnagel, 2014).Тем не менее, в растениях было зарегистрировано несколько примеров sPEP, кодируемых этими транскриптами (Tavormina et al., 2015). Одним из этих генов растений, кодирующих sPEP и lncRNA, является хорошо изученный, но все еще загадочный ген ENOD40 бобовых. ENOD40 Экспрессия индуцируется в зачатке зарождающегося клубенька, и его экспрессия находится под контролем сигнального каскада раннего симбиоза (Frugier et al., 2008). Оба штамма M. truncatula и L. japonicus имеют две копии генов ENOD40 , и их пониженная регуляция или избыточная экспрессия в трансгенных растениях приводят к уменьшенной или усиленной инициации клубеньковых зачатков соответственно (Charon et al.1999; Кумагай и др., 2006; Wan et al., 2007). Таким образом, гены играют ключевую роль в инициации клубеньков и создании зачатка клубеньков. В гене ENOD40 отсутствует длинная ORF, но присутствуют несколько sORF, некоторые из которых являются консервативными среди видов растений, в частности два sORF, кодирующих пептиды ENOD40-I (13 аминокислот) и ENOD40-II (27 аминокислот) (Sousa et al. al., 2001). Транслябельность sORFs была предложена in vivo трансляционных GUS-слияний, экспрессированных в корнях Medicago sativa .Кроме того, пептид ENOD40 сои может быть обнаружен с помощью вестерн-блоттинга (Röhrig et al., 2002). Было обнаружено, что баллистическое микротаргетирование гена ENOD40 в корковые клетки корня M. sativa вызывает клеточные деления, которые соответствуют ранним этапам инициации клубеньков (Charon et al., 1997; Sousa et al., 2001). ENOD40 вариантов были использованы в этом анализе, чтобы продемонстрировать, что пептиды ENOD40-I и ENOD40-II, а также структурированная РНК-область транскрипта участвуют в выявлении делений корковых клеток (Sousa et al., 2001). Другая сообщенная клеточная активность гена M. truncatula ENOD40 заключается в повторной локализации РНК-связывающего белка MtRBP1 из ядра в цитоплазму (Campalans et al., 2004). Перераспределение MtRBP1 зависит от ENOD40 РНК. Тем не менее, ENOD40 -кодированные пептиды, по-видимому, не участвуют в этой активности, потому что мутантные ENOD40 гены, у которых были кодированы ATG-кодоны инициации трансляции пептидов, все еще были способны индуцировать цитоплазматическую локализацию MtRBP1.Более того, Laporte et al. (2010) сообщили о связывании молекулы ENOD40 РНК также с пептидами SNARP, которые более подробно описаны ниже. Можно предположить, что формирование ENOD40 РНК-белковых взаимодействий может быть связано с облегчением трансляции небольших белков, таких как SNARP. Картина еще более сложная, поскольку было также обнаружено, что sEPEP ENOD40 сои, называемые ENOD40-A и ENOD40-B, ковалентно связываются с сахарозосинтазой, стимулируя тем самым ее активность по расщеплению сахарозой и стабильность белка.Это говорит о том, что пептиды ENOD40 участвуют в контроле использования сахарозы в зарождающихся клубеньках (Röhrig et al., 2002, 2004). Поскольку активность сахарозосинтазы в растительных тканях и органах коррелирует с силой поглощения этих тканей, способностью привлекать сахарозу, а также потому, что сахарозосинтаза участвует в инициации клубеньков и необходима для эффективной фиксации азота в клубеньках, было предложено, чтобы ENOD40 пептиды могут увеличивать силу поглощения углерода в предварительно делящихся корковых клетках коры и в зрелых клубеньковых тканях (Röhrig et al., 2002, 2004).

Таким образом, в целом, по-видимому, генов ENOD40 бобовых действуют как в качестве структурированной молекулы РНК, так и путем кодирования sPEP (Bardou et al., 2011). Однако то, как сообщаемые активности молекулы РНК или sPEP связаны с ключевыми функциями ENOD40 в активации клеточных делений в коре корня и инициации клубенькового зачатка, остается загадкой, которая требует дополнительных исследований.

пептидов растений, регулирующих номер узла

CLE пептиды, сигналы в авторегулировании нодуляции

Завод должен поддерживать баланс между выгодами и затратами на формирование и функционирование симбиотического клубенька, которые являются процессами, требующими энергии и углерода.Вот почему бобовые контролируют количество клубеньков, образованных на их корнях. Как доступные источники азота (в основном, нитратов), так и вновь образующиеся узелки ограничивают начало и прогрессирование развития узелков в зоне, подверженной ризобиальной инфекции (Pierce and Bauer, 1983). Kosslak и Bohlool (1984) продемонстрировали в экспериментах по инокуляции с расщепленным корнем существование механизма передачи сигналов на большие расстояния, называемого ауторегуляцией

Минутку …

Пожалуйста, включите Cookies и перезагрузите страницу.

Этот процесс автоматический. Ваш браузер будет перенаправлен на запрошенный контент в ближайшее время.

Пожалуйста, подождите до 5 секунд …

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ [] + (!! []) — (! + [] — (!! []) []) +) + (+ [] + (!! [!]) +! ! [] + !! []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [+ !! [] + !! [] + !!] [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! [!]) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [])) / + ( (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] +! ! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [ ]) + (+ [] + (!! [!]) — []) + (+ !! []) + (+ [] + (!! [!]) + !! []) + (+! [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []))

+ ((! + [] + (!! [ ]) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [ ] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (! ! []) + !! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) +! ! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + ( ! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (+ [] — (!! []!)) + (+ [] + (!! []) + !! [] +! ! [] + !! [] + !! [] + !! []))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ [] + (!! [!]) — []) + (+ [] — ( !! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! [] ) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! [!]) — []) + ( ! + [] + (!! []) + !! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ !! []) + (+ !! []) + (+ !! []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) — []))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + ( ! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (! ! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] +! ! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [] — (!! [])))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] +! ! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) +! ! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (! ! []) -! []) + (+ [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! []) + !! [] )) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (! ! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [ ] + !! []) + (+ [] + (!! [!]) — []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (+ [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! [])) + (+ [] + (!! []) + !! [] + !! [!]) + (+ !! []) + (+! [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] +! ! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + []) + (+ [] — (!! [])) + (+ !! []) + (+ [] + (!!! []) -! []) + (+ [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [ ]))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] +! ! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) +! ! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (! ! []) -! []) + (+ [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! []) + !! [] )) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [ ] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! [!]) + !! [] + !! []) + (+ [] — (! ! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] — (!! [])))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ !! []) + (! + [] — (!! [])) + (+ [] + (!! [!]) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] +! ! []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [+ !! [] + !!] [] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ !! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + []) + (+ [] + (!! [!]) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! [!]) — []) + (+ [] + (!! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! [ ]) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [ ] + !! []))

+ ((! + [] + (!! []) +! ! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! []!)) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! []) — (! + [] + (!! []) []) + + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [])) / + ((+ [] + (!! [!]) — [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! [!]) — []) + + (+ [] + (!! []!)! ! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + ( ! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []))

+ ((! + [] + (!! [] ) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (+ [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) — [])! + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ [] + (!! []) + !! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! [] ) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (! ! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] +! ! []) + (! + [] + (!! [])