Связь ядра и цитоплазмы осуществляется через: Транспортные процессы между ядром и цитоплазмой

Транспортные процессы между ядром и цитоплазмой

Когда речь заходит о различиях между про- и эукариотическими клетками, то первым, что можно услышать в ответ, будет замечание о том, что эукариоты обладают ограниченным мембранами ядром, тогда как прокариоты являются безъядерными. И хотя у про- и эукариотов еще множество иных отличий, тем не менее основным признаком, по которому эти организмы делят на два домена, является именно наличие либо отсутствие ядра, что указывает на фундаментальное значение этого органоида. Ядро представляет собой не просто один из многих компартментов внутри клетки, но берет на себя функции основного регулятора ее жизнедеятельности.

Чтобы понять, как же ядро исполняет возложенные на него обязанности, и почему его наличие настолько преображает внутриклеточные процессы, обратимся к его устройству. Ядерная оболочка состоит из двух концентрических фосфолипидных мембран — наружной и внутренней, — удаленных друг от друга на 30 нм (рис. 1).

Рисунок 1 | Ядерная оболочка, цитоплазматическая сторона (атомно-силовая микроскопия).

Надо сказать, такая двухслойная оболочка представляет собой куда более серьезный барьер, чем одинарная цитоплазматическая мембрана, окружающая клетку. Наружная мембрана ядерной оболочки неразрывно связана с лабиринтами ЭПР, а внутренняя мембрана — с сетью промежуточных филаментов, которая сформирована белком ламином и называется ядерной пластинкой, служащей местом прикрепления хромосом. Как и любой другой мембранный компонент, ядерная оболочка обладает избирательной проницаемостью, что необходимо для контролируемого перемещения различных соединений между ядром и цитоплазмой. Такое свойство ядерной оболочке обеспечивают белковые комплексы нуклеопоринов, представляющих собой ядерные поры (nuclear pore complex, NPC), которые в огромном количестве (от двух до пяти тысяч в клетках позвоночных) испещряют мембраны, окружающие ядро (рис. 2).

Рисунок 2 | Схематичная структура NPC.

В состав одного комплекса ядерной поры входят различные виды нуклеопоринов (коих около 30-ти), скомпонованных в субкомплексы, каждый из которых представлен несколькими копиями, в результате чего полностью собранный NPC включает в себя от 500 до 1000 отдельных белков. NPC соединяют наружную и внутреннюю мембраны оболочки ядра, формируя при этом водные каналы. Благодаря методам криоэлектронной микроскопии и томографии стало возможным внимательное рассмотрение структуры ядерных пор: центральный канал каждой поры окружен тремя последовательно уходящими вглубь кольцевыми структурами, к которым как со стороны цитоплазмы, так и со стороны ядра прикрепляются белковые нити, что в совокупности по своему виду напоминает корзину (да собственно, так и называется — nuclear basket). Транспорт солей, нуклеотидов, небольших молекул и компонентов, требующихся для синтеза ДНК и РНК, осуществляется через NPC путем пассивной диффузии (рис. 3).

Рисунок 3 | Транспорт молекул через ядерную мембрану.

Механизм ядерного транспорта молекул, размер которых не превышает 40 кДа (и диаметром 4–5 нм), заключается в прохождении через NPC без специфического распознавания, путем пассивной диффузии. Более крупные молекулы (белки, некоторые мРНК) связываются с транспортными рецепторами, распознающими особые аминокислотные последовательности (NLS, NES). Пояснения в тексте.

Для импорта в ядро крупных белков, размером крупнее 40–65 кДа, требуется участие транспортных рецепторов, которые чувствительны к сигналам, посылаемым транспортируемыми белками. Одним только созданием диффузионного барьера и контролем ядерно-цитоплазматического транспорта функции NPC не ограничиваются. Данные белковые комплексы задействованы также в таких ядерных процессах, как восстановление ДНК, клеточный цикл, организация хроматина, регуляция транскрипции, созревание РНК (рис. 4).

Рисунок 4 | Схематичное представление механизмов ядерно-цитоплазматического импорта и экспорта. Пояснения в тексте.

Обратимся более подробно к упомянутым сигналам, необходимым для переноса крупных белков в ядро или из него. Растворимые транспортные рецепторы семейства кариоферинов распознают в структуре белков специфические аминокислотные последовательности, к которым относятся сигнал ядерной локализации (NLS) и сигнал ядерного экспорта (NES). Распознав нужный участок (типичным признаком NLS является повторение нескольких положительно заряженных аминокислот — лизин, аргинин), транспортные рецепторы либо связываются с ним напрямую, либо с помощью адапторных молекул, в результате чего запускается процесс транслокационных изменений.

Передача сигнала может происходить путем различных механизмов, которые классифицируют по функциональным особенностям NLS.

Например, первыми описанными сигнальными последовательностями были короткие, богатые лизином участки, которые впоследствии стали относить к классическим NLS. Такие NLS связывают домен ARM на С-терминальном конце импортина-α, выполняющего роль адапторного белка, а он, в свою очередь, связывает транспортный рецептор импортин-β, взаимодействуя с доменом αIBB на его N-терминальном конце, то есть, формируется трехкомпонентный комплекс, включающий в себя перемещаемый белок, адаптор и транспортный рецептор. В противоположность данному типу NLS, неклассические NLS связываются с транспортным рецептором без участия адапторных молекул. Например, к белкам, непосредственно распознаваемым импортином-β, относятся рибосомальные белки, транскрипционный фактор CREB, вирусные белки Rev и Tat вируса иммунодефицита человека, SREBP-2, белок Rex Т-лимфотропного вируса человека 1-го типа, циклин В1, Smad3 и т. д.

Теперь, когда с сигнальными последовательностями относительно разобрались, встает вопрос: «А что же с рецепторами?».

У них также имеются важные структурные особенности, обеспечивающие взаимодействие с белками и их перенос. В частности, рецепторы ядерного транспорта, постоянно перемещающиеся между ядром и цитоплазмой, в большинстве своем относятся к семейству β-кариоферина, каждый представитель которого «узнает» специфичную для него группу белков или РНК.

Характерным признаком членов данного семейства рецепторных белков является наличие многоповторных HEAT-мотивов, сформированных двумя антипараллельными амфифильными спиралями, соединенными линкерной областью. Именно эти структуры ответственны за узнавание транспортируемых белков, опосредованное ГТФазой Ran, а также за высвобождение белков после переноса. Таким образом, ГТФаза Ran и белок, который необходимо протащить через ядерную пору, связываются с суперспиралью рецептора изнутри, а нуклеопорины связываются с рецепторами через FG-мотивы снаружи, и таким образом, путем многократных последовательных связываний и разобщений NPC с рецептором белок транспортируется через пору. Кроме того, важно, чтобы комплексы ядерных пор поддерживали гидрофобное микроокружение, поскольку это критично для рецептор-опосредованного транспорта.

По данным кристаллографического анализа комплекса FG-мотива импортина-β, данный рецептор обладает несколькими гидрофобными карманами на выпуклой поверхности, которые предназначены для взаимодействия с гидрофобными остатками FG-Nup (встречаются в составе нуклеопоринов, составляющих комплексы ядерных пор). Отсюда также следует, что помимо размера белка его гидрофобность тесно связана с его способностью проходить через ядерные поры. Однако сильная поверхностная гидрофобность и сильные связи с нуклеопоринами не объясняют в полной мере скорость перемещения белка через NPC, поскольку гидрофобные белки застревают в NPC на некоторое время и не так-то легко высвобождаются в цито-/нуклеоплазму.

При импорте какого-либо белка со стороны ядра к транспортному комплексу присоединяется уже неоднократно упоминаемая ГТФаза Ran, что необходимо для диссоциации импортина-β и высвобождения переносимого субстрата в кариолимфу (рис. 5, 6).

Рисунок 5 | Ядерный импорт.

После связывания транспортируемой молекулы в цитоплазме импортины способны взаимодействовать с белками NPC и проходить через центральный канал поры. Оказавшись внутри ядра, комплекс импортина с транспортируемой им молекулой связывается с ГТФазой Ran, что ведет к конформационным изменениям, способствующим высвобождению груза. После высвобождения белка импортин и ГТФаза перебрасываются в цитоплазму.

Рисунок 6 | Схема участия нуклеопоринов в ядерном транспорте.

А — рецептор-независимый импорт (бета-катенин взаимодействует с белками NPC напрямую).
В — классический рецептор-зависимый импорт транспортируемой молекулы с образованием комплекса с α- и β-импортинами.
С — особый способ, характерный для некоторых типов белковых молекул, когда возможно взаимодействие как с нуклеопоринами без посредников, так и с участием импортинов.

Ran представляет собой гуаниннуклеотидсвязывающий белок, который может находиться в форме Ran-ГТФ или Ran-ГДФ, в зависимости от того, в каком компартменте клетки он находится. Внутри ядра белок Ran-GEF (фактор обмена гуаниновых нуклеотидов) заботится о том, чтобы Ran оставался связанным с ГТФ. После диссоциации импортинов (как α, так и β) каждый из них своим путем возвращается назад в цитоплазму, чтобы снова участвовать в импорте белков. Импортин-α экспортируется в цитоплазму по Ran-зависимому механизму с помощью рецепторов CAS (cellular apoptosis susceptibility — клеточной чувствительности к апоптозу). Импортин-β выносится из ядра в комплексе с ГТФазой Ran, что препятствует его повторному связыванию с импортином-α в ядре.

Перешедшая таким образом в цитоплазму ГТФаза Ran в комплексе с импортином-β связывается ГТФаза-активирующим белком (GAP), и буквально в следующее мгновение ГТФ гидролизуется до ГДФ. После гидролиза импортин и Ran-ГДФ диссоциируют на отдельные компоненты, и импортин готов для следующего цикла импорта белков внутрь ядра. А Ran-ГДФ, в свою очередь, доставляется назад транспортным фактором NTF-2 (не относится к семейству импортина-β), который специфичен для Ran. В ядре Ran снова принимает форму ГТФ-связанного белка и готовится выполнять свои функции как в качестве помощника для высвобождения транспортируемого белка при импорте в ядро, так и для формирования транспортного комплекса при экспорте белковых молекул из ядра.

Кроме того, существует путь транспорта между ядром и цитоплазмой, для которого участие транспортных рецепторов, таких как импортин-β, не является ключевым моментом. В этом случае перемещаемый белок связывается напрямую с белками NPC (такой транспорт описан, например, для белка Vpr ВИЧ), катализируя свой перенос самостоятельно, без участия каких-либо растворимых факторов.

Через каждую пору ядерной мембраны возможен как импорт, так и экспорт белков (рис. 7).

Рисунок 7 | Ядерный экспорт.

Экспортины связываются с ГТФазой Ran и экспортируемым белком в ядре; весь комплекс преодолевает центральный канал и оказывается в цитоплазме. Ran-GAP (совместно с RANBP1 и RANBP2) активирует гидролиз ГТФ, связанного с Ran. В итоге Ran-ГДФ взаимодействует с NTF2 и передислоцируется в ядро, где с помощью RAN-обменного фактора RCC1 восстанавливается уровень Ran-ГТФ.

Как уже было сказано выше, размер транспортируемого белка не является единственной детерминантой, предполагающей активный или пассивный транспорт. В том числе это подтверждается тем, что хотя крупные белки и не могут диффундировать через ядерные поры, тем не менее далеко не все небольшие молекулы свободно проникают через ядерную оболочку, напротив, многие из них все равно транспортируются по механизму активного транспорта, т. к. этот процесс подвержен более строгой регуляции.

Например, активный транспорт предполагает вовлечение определенных сигнальных путей, тогда как в отсутствие сигнала нуклеопорины не проявляют аффинных свойств к субстратам. В то же время, мнение ученых о механизмах пассивного транспорта разнятся. Одни придерживаются представления о том, что по краю NPC, вокруг центрального канала поры, располагается восемь маленьких каналов, через которые небольшие молекулы и ионы беспрепятственно диффундируют внутрь ядра (рис. 3).

Другие ученые предполагают, что существует все же только один канал, по которому осуществляется как диффузия, так и активный транспорт. Долгое время считалось, что пассивный транспорт никак не регулируется, кроме как размером пропускного канала, однако позже была выяснена зависимость пропускной способности NPC от концентрации ионов кальция в просвете ядерных пор, что дает возможность для управления и пассивным транспортом молекул.

Источники:

Dickmanns A., Kehlenbach R. H., Fahrenkrog B. Nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport: from structure to function to disease //International review of cell and molecular biology. – Academic Press, 2015. – Т. 320. – С. 171-233.
Milles S. et al. Plasticity of an ultrafast interaction between nucleoporins and nuclear transport receptors //Cell. – 2015. – Т. 163. – №. 3. – С. 734-745.
Cautain B. et al. Components and regulation of nuclear transport processes //The FEBS journal. – 2015. – Т. 282. – №. 3. – С. 445-462.
Yoshimura S. H., Kumeta M., Takeyasu K. Structural mechanism of nuclear transport mediated by importin β and flexible amphiphilic proteins //Structure. – 2014. – Т. 22. – №. 12. – С. 1699-1710.
Raices M., D’angelo M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions //Nature reviews Molecular cell biology. – 2012. – Т. 13. – №. 11. – С. 687.
Monecke T. et al. Crystal structure of the nuclear export receptor CRM1 in complex with Snurportin1 and RanGTP //Science. – 2009. – Т. 324. – №. 5930. – С. 1087-1091.

Ядерно-цитоплазматический транспорт | это… Что такое Ядерно-цитоплазматический транспорт?

Материальный обмен между ядром и цитоплазмой клетки осуществляется посредством ядерных пор — транспортных каналов, пронизывающих двухслойную ядерную оболочку. Переход макромолекул из ядра в цитоплазму и в обратном направлении называется ядерно-цитоплазматическим транспортом.

Содержание

1 Структура
2 Свойства ядерных пор
- 2.1 Нуклеопорины
3 Ядерно-цитоплазматический транспорт
- 3. 1 Пассивный транспорт
- 3.2 Активный транспорт
  - 3.2.1 Механизм импорта белков в ядро
  - 3.2.2 Механизм экспорта белков из ядра
4 Ссылки

Структура

Реконструкция ядерной поры.

Ядерные поры — это не просто перфорации, а сложно устроенные, многофункциональные регулируемые структуры, организованные приблизительно 30 белками —

нуклеопоринами. Белковая составляющая ядерной поры обозначается термином «комплекс ядерной поры» (англ., nuclear pore complex, NPC). Масса комплекса ядерной поры колеблется в пределах от ~44 МДа в клетках дрожжей до ~125 МДа у позвоночных.

По данным электронной микроскопии, ядерные поры в поперечном сечении имеют форму «восьмиспицевого тележного колеса», то есть имеют ось симметрии восьмого порядка. Эти данные подтверждает тот факт, что молекулы нуклеопоринов присутствуют в составе ядерной поры в количестве, кратном восьми. Проницаемый для молекул канал располагается в центре структуры.

Комплекс ядерной поры заякорен на ядерной оболочке с помощью трансмембранной части, от которой к просвету канала обращены структуры, получившие название спиц (англ., spokes), по аналогии со спицами тележного колеса. Эта коровая часть поры, построенная из восьми доменов, с цитоплазматической и ядерной сторон ограничена соответственно цитоплазматическим и ядерным кольцами (англ., rings; у низших эукариот они отсутствуют). К ядерному кольцу прикреплены белковые направленные внутрь ядра тяжи (ядерные филаменты, англ., filaments), к концам которых крепится терминальное кольцо (англ., terminal ring). Вся эта структура носит название ядерной корзины (англ., nuclear basket). К цитоплазматическому кольцу также прикреплены направленные в цитоплазму тяжи — цитоплазматические филаменты. В центре ядерной поры видна электрон-плотная частица, «втулка» или транспортер (англ., plug).

Физические размеры ядерной поры высших эукариот. Вид сверху и сбоку.

Свойства ядерных пор

Количество ядерных пор на одно ядро может колебаться от 190 у дрожжей, 3000-5000 в клетках человека, до 50 млн в зрелых ооцитах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis). Этот показатель может также варьировать в зависимости от типа клетки, гормонального статуса и стадии клеточного цикла. Например, в клетках позвоночных количество ядерных пор удваивается на протяжении S фазы, одновременно с удвоением хромосом. При разборке ядерной оболочки во время митоза ядерные поры позвоночных распадаются на субкомплексы с массами около миллиона дальтон. Показано, что разборка комплекса ядерной поры инициируется циклин B-зависимой киназой, фосфорилирующей нуклеопорины. После завершения клеточного деления ядерные поры собираются

de novo. Ядерные поры интерфазного ядра перемещаются большими массивами, а не независимо друг от друга, причем эти перемещения происходят синхронно с перемещениями ядерной ламины. Это служит доказательством того, что ядерные поры механически связаны между собой и формируют единую систему (англ.

, NPC network).

Нуклеопорины

Нуклепорины, белки из которых постоены ядерные поры, делят на три подгруппы. К первой относят трансмембранные белки, заякоривающие комплекс в ядерной оболочке. Нуклепорины второй группы содержат характерный аминокислотный мотив — несколько раз повторенные FG, FXFG или GLFG — последовательности (так называемые FG-повторы, где F — фенилаланин, G — глицин, L — лейцин, X — любая аминокислота). Функция FG-повторов, по-видимому, заключается в связывании транспортных факторов, необходимых для осуществления ядерно-цитоплазматического транспорта. Белки третьей подгруппы не имеют ни мембранных доменов, ни FG- повторов, наиболее консервативны среди всех нуклеопоринов, их роль, по-видимому, заключается в обеспечении связывания FG-содержащих нуклепоринов с трансмембранными. Нуклеопорины также отличаются по своей мобильности в составе ядерной поры. Некоторые белки связаны с конкретной порой на протяжении всего клеточного цикла, в то время как другие полностью обновляются всего за несколько минут.

Ядерно-цитоплазматический транспорт

Ядерно-цитоплазматическим транспортом называется материальный обмен между ядром и цитоплазмой клетки. Ядерно-цитоплазматический транспорт можно разделить на две категории:

активный транспорт, требующий затрат энергии, а также специальных белков-рецепторов, и пассивный транспорт, протекающий путем простой диффузии молекул через канал ядерной поры.

Пассивный транспорт

Молекулы небольших размеров (ионы, метаболиты, мононуклеотиды и т. д.) способны пассивно диффундировать в ядро. Проводимость ядерных пор для молекул разных размеров различна. Белки массой менее 15 кДа быстро проникают в ядро, в то время как для белка массой более 30 кДа на это требуется определенное время. Белковые молекулы массой более 60-70 кДа, по-видимому, вообще не могут пассивно проходить через ядерные поры. Впрочем, пропускная способность ядерных пор для пассивной диффузии может изменяться в зависимости от типа клетки и стадии клеточного цикла.

Активный транспорт

Цикл Ran.
1. Транслокация Ran-ГТФ в цитоплазму в комплексе с транспортинами. 2. Гидролиз ГТФ. Собственная ГФАзная активность Ran активируется цитоплазматическим белком RanGAP. 3. Ran-ГДФ реимпортируется в ядро при участии белка NTF2. 4. ГДФ в активном центре Ran заменяется на ГТФ под действием ядерного белка RCC1 (фактора обмена нуклеотидов).

Пропускная способность ядерной поры для активного транспорта значительно выше. Так рибосомные субчастицы размерами до нескольких мегадальтон транспортируются из ядра в цитоплазму через ядерные поры, и нет никаких оснований предполагать, что процесс транспорта сопровождается частичной разборкой этих субчастиц. Системы активного транспорта обеспечивают весь макромолекулярный обмен между ядром и цитоплазмой. Молекулы РНК, синтезируемые в ядре, поступают через поры в цитоплазму, а в ядро попадают белки участвующие в ядерном метаболизме. Причем одни белки должны поступать в ядро конститутивно (например, гистоны), а другие в ответ на определенные стимулы (например, транскрипционные факторы).

У ядерных белков идентифицированы специальные последовательности, отвечающие за их локализацию. Самая распространенная из них, так называемый «классический» сигнал ядерной локализации — NLS (от англ., Nuclear Localization Signal), представляет собой один или два участка положительно заряженных аминокислот, аргинина и лизина. Транслокация белков в ядро, в отличие от транслокации в митохондрии и эндоплазматический ретикулум, не сопровождается отщеплением этой сигнальной последовательности и разворачиванием полипептидной цепи. NLS-содержащие белки, как и все другие субстраты систем ядерного транспорта, переносятся в ядро в комплексе со специальными белками — транспортинами или кариоферинами (англ., transportins, karyopherins). Каждый транспортин или комплекс транспортинов для осуществления своей функции должен обладать тремя активностями: во-первых, он должен узнавать и связывать транспортируемый субстрат, во-вторых, заякориваться на ядерной поре, и в-третьих, связывать небольшой белок — GTPазу Ran, относящуюся к семейству Ras-подобных ГТФаз и служащую для сопряжения транспорта с гидролизом ГТФ, что придает процессу необратимость (снабжает его энергией).

Собственно акт гидролиза ГТФ осуществляется непосредственно этим белком. Фактор обмена нуклеотидов (англ., GTPase Е

xchange Factor, GEF) для Ran, хроматин-связывающй белок RCC1, локализован строго в ядре, а активаторы ГТФазной активности (англ., GTPase Activation Protein, GAP) RanGAP1 и некоторые другие белки — строго в цитоплазме. Эта асимметричная локализация приводит к формированию градиента: в ядре находится преимущественно ГТФ-связанная форма Ran, в цитоплазме, наоборот, ГДФ-связанная. Ran используется для снабжения энергией как процессов импорта, так и процессов экспорта различных субстратов, а вся схема носит название Ran-цикла (англ., Ran-cycle). Ran-цикл снабжает энергией и экспорт, и импорт, используя общий принципиальный механизм, ключевыми стадиями которого являются гидролиз ГТФ в цитоплазме и обмен ГДФ на ГТФ в ядре.

Схема импорта белков в ядро.
1. Образование комплекса груз-рецептор (импортин). 2. Заякоривание комплекса на белках ядерной поры и собственно транслокация. 3. Диссоциация комплекса груз-импортин под воздействием Ran-ГТФ, высвобождение груза, образование комплекса Ran-ГТФ-импортин. 4. Реэкспорт образовавшегося комплекса в цитоплазму. 5. Гидролиз ГТФ и диссоциация комплекса.

Механизм импорта белков в ядро

Рассмотрим механизм поступления субстратов в ядро на примере импорта NLS-содержащих белков. Первой стадией транспортировки является узнавание субстрата транспортинами, в данном случае комплексом импортинов-α/β (транспортины участвующие в транспорте в ядро называются импортинами, а из ядра — экспортинами). Затем образовавшийся комплекс заякоривается на белках ядерной поры с цитоплазматической стороны и транслоцируется через канал в ядро, где с ним связывается Ran-ГТФ, что вызывает диссоциацию комплекса и высвобождение груза. После чего импортины в комплексе с Ran-ГТФ направляются обратно в цитоплазму, где Ran под действием RanGAP1 гидролизует ГТФ (ГТФ => ГДФ + PO₄^3-). Комплекс Ran-ГДФ-импортины α/β нестабилен и диссоциирует. Ran-ГДФ поступает обратно в ядро при помощи собственного переносчика, димерного белка NTF2. В ядре под действием белка RanGEF, ГДФ в активном центре Ran заменяется на ГТФ и цикл, тем самым, замыкается.

Схема экспорта белков из ядра.
1. Образование комплекса груз-экспортин-Ran-ГТФ. 2. Заякоривание комплекса на белках ядерной поры и собственно транслокация. 3. Гидролиз ГТФ, диссоциация комплекса и высвобождение груза. 4. Реимпорт высвободившегося экспортина.

Механизм экспорта белков из ядра

Теперь рассмотрим механизм экспорта из ядра на примере белков, содержащих сигналы ядерного экспорта (англ., Nuclear Export Signal, NES). Для последовательностей этих сигналов характерно содержание гидрофобных аминокислот. Первой стадией транспортировки здесь также является рецепция субстрата специфическим экспортином Crm1 (англ., Chromosome Region Maintenance) и образование комплекса. Главным отличием механизмов импорта является тот факт, что в состав транслоцирующегося комплекса в случае экспорта помимо субстрата и Crm1 входит и Ran-ГТФ, то есть сопряжение с циклом Ran происходит на стадии транслокации, а не на стадии реимпорта рецептора. После прохождения через ядерную пору в цитоплазму, Ran расщепляет ГТФ, комплекс теряет стабильность и диссоциирует, высвобождая груз.

Ссылки

Molecular Biology Of The Cell, 4е издание, 2002 г. — учебник по молекулярной биологии на английском языке

Ядерная оболочка и движение между ядром и цитоплазмой — Клетка

Ядерная оболочка отделяет содержимое ядра от цитоплазмы и обеспечивает структурную основу ядра. Ядерные мембраны, действующие как барьеры, препятствующие свободному прохождению молекул между ядром и цитоплазмой, сохраняют ядро как отдельный биохимический компартмент. Единственные каналы через ядерную оболочку обеспечиваются комплексами ядерных пор, которые обеспечивают регулируемый обмен молекулами между ядром и цитоплазмой. Избирательный трафик белков и РНК через комплексы ядерных пор не только устанавливает внутренний состав ядра, но также играет критическую роль в регуляции экспрессии эукариотических генов.

Структура ядерной оболочки

Ядерная оболочка имеет сложную структуру, состоящую из двух ядерных мембран, нижележащей ядерной пластинки и комплексов ядерных пор (). Ядро окружено системой из двух концентрических мембран, называемых внутренней и внешней ядерными мембранами. Наружная ядерная мембрана является продолжением эндоплазматического ретикулума, поэтому пространство между внутренней и наружной ядерными мембранами непосредственно связано с просветом эндоплазматического ретикулума. Кроме того, наружная ядерная мембрана функционально сходна с мембранами эндоплазматического ретикулума (см. главу 9).) и имеет рибосомы, связанные с его цитоплазматической поверхностью. Напротив, внутренняя ядерная мембрана несет уникальные белки, специфичные для ядра.

Рисунок 8.1

Ядерная оболочка. (A) Электронная микрофотография ядра. Внутренняя и внешняя ядерные мембраны соединяются комплексами ядерных пор (стрелки). (B) Электронная микрофотография, иллюстрирующая непрерывность внешней ядерной мембраны с эндоплазматической (подробнее…)

Важнейшая функция ядерных мембран состоит в том, чтобы выступать в качестве барьера, отделяющего содержимое ядра от цитоплазмы. Как и другие клеточные мембраны, ядерные мембраны представляют собой бислои фосфолипидов, которые проницаемы только для небольших неполярных молекул (см. Ресурсы). Другие молекулы не могут диффундировать через бислой фосфолипидов. Внутренняя и внешняя ядерные мембраны соединяются в комплексах ядерных пор, единственных каналах, по которым небольшие полярные молекулы и макромолекулы могут проходить через ядерную оболочку (11). Как обсуждается в следующем разделе, комплекс ядерных пор представляет собой сложную структуру, ответственную за избирательный транспорт белков и РНК между ядром и цитоплазмой.

Рисунок 8.2

Электронная микрофотография, показывающая ядерные поры. Много ядерных пор (стрелки) видны на этом препарате ядерной оболочки после замораживания. (Photo Researchers, Inc.)

В основе внутренней ядерной мембраны лежит ядерная пластинка, волокнистая сеть, обеспечивающая структурную поддержку ядра (). Ядерная пластинка состоит из одного или нескольких родственных белков, называемых ламинами. Большинство клеток млекопитающих, например, содержат четыре различных ламина, обозначенных как A, B ₁ , B ₂ и C. Все ламины представляют собой волокнистые белки массой от 60 до 80 килодальтон (кДа), родственные белкам промежуточных филаментов цитоскелета (см. главу 11). Подобно другим белкам промежуточных филаментов, ламины связываются друг с другом, образуя филаменты. Первой стадией этой ассоциации является взаимодействие двух ламинов с образованием димера, в котором α-спиральные области двух полипептидных цепей закручены друг вокруг друга в структуру, называемую спиральной спиралью. Затем эти димеры ламинов связываются друг с другом, образуя филаменты, из которых состоит ядерная пластинка. Ассоциации ламинов с внутренней ядерной мембраной способствует посттрансляционное добавление липидов, в частности, пренилирование С-концевых остатков цистеина (see). Кроме того, ламины связываются с белками внутренней ядерной мембраны, что может помочь организовать филаменты ламина в сеть и опосредовать их прикрепление к мембране.

Рисунок 8.3

Электронная микрофотография ядерной пластинки. Пластинка представляет собой сеть филаментов, лежащих в основе внутренней ядерной мембраны. (Из U. Aebi, J. Cohn, L. Buhle and L. Gerace, 1986. Nature 323: 560.)

Рисунок 8.4

Модель сборки ламината. Ламиновые полипептиды образуют димеры, в которых центральные α-спиральные участки двух полипептидных цепей закручены друг вокруг друга. Дальнейшая сборка может включать ассоциацию димеров «голова к хвосту» с образованием линейных полимеров (подробнее…)

Помимо обеспечения структурной поддержки ядра, считается, что ядерная пластинка служит местом прикрепления хроматина. Хроматин внутри ядра организован в виде больших петель ДНК, некоторые из которых, по-видимому, связаны с ядерной оболочкой. Ламины связывают хроматин и могут способствовать этому взаимодействию.

Комплекс ядерных пор

комплексов ядерных пор являются единственными каналами, по которым небольшие полярные молекулы, ионы и макромолекулы (белки и РНК) могут перемещаться между ядром и цитоплазмой. Комплекс ядерных пор представляет собой чрезвычайно большую структуру диаметром около 120 нм и расчетной молекулярной массой около 125 миллионов дальтонов, что примерно в 30 раз превышает размер рибосомы. У позвоночных комплекс ядерных пор состоит из 50–100 различных белков. Контролируя движение молекул между ядром и цитоплазмой, комплекс ядерных пор играет фундаментальную роль в физиологии всех эукариотических клеток. РНК, которые синтезируются в ядре, должны эффективно экспортироваться в цитоплазму, где они участвуют в синтезе белка. И наоборот, белки, необходимые для ядерных функций (например, факторы транскрипции), должны транспортироваться в ядро из мест их синтеза в цитоплазме. Кроме того, многие белки постоянно перемещаются между ядром и цитоплазмой. Таким образом, регулируемый трафик белков и РНК через комплекс ядерных пор определяет состав ядра и играет ключевую роль в экспрессии генов.

В зависимости от размера молекулы могут проходить через комплекс ядерных пор с помощью одного из двух различных механизмов (). Небольшие молекулы и некоторые белки с молекулярной массой менее примерно 50 кД свободно проходят через ядерную оболочку в любом направлении: цитоплазма-ядро или ядро-цитоплазма. Эти молекулы пассивно диффундируют через открытые водные каналы диаметром около 9 нм в комплексе ядерных пор. Однако большинство белков и РНК не могут пройти через эти открытые каналы. Вместо этого эти макромолекулы проходят через комплекс ядерных пор посредством активного процесса, при котором соответствующие белки и РНК распознаются и избирательно транспортируются только в одном направлении (ядро в цитоплазму или цитоплазму в ядро). Движение этих молекул происходит через регулируемые каналы в комплексе ядерных пор, которые в ответ на соответствующие сигналы могут открываться до диаметра более 25 нм — размера, достаточного для размещения больших рибонуклеопротеиновых комплексов, таких как рибосомные субъединицы. Именно через эти регулируемые каналы ядерные белки избирательно импортируются из цитоплазмы в ядро, тогда как РНК экспортируются из ядра в цитоплазму.

Рисунок 8.5

Молекулярный трафик через комплексы ядерных пор. Небольшие молекулы способны быстро проходить через открытые каналы в комплексе ядерных пор за счет пассивной диффузии. Напротив, макромолекулы транспортируются избирательным, энергозависимым механизмом, который (подробнее…)

Визуализация комплексов ядерных пор с помощью электронной микроскопии обнаруживает структуру с восьмикратной симметрией, организованную вокруг большого центрального канала (), который является маршрутом через которые белки и РНК пересекают ядерную оболочку. Детальные структурные исследования, включая компьютерный анализ изображений, привели к разработке трехмерных моделей комплекса ядерных пор (). Эти исследования показывают, что комплекс ядерных пор состоит из восьми спиц, расположенных вокруг центрального канала. Спицы соединены с кольцами на ядерной и цитоплазматической поверхностях, а сборка спиц-кольцо закреплена внутри ядерной оболочки в местах слияния внутренней и внешней ядерных мембран. Белковые филаменты отходят как от цитоплазматического, так и от ядерного кольца, образуя отчетливую корзинкообразную структуру на ядерной стороне. Центральный канал имеет диаметр примерно 40 нм, что достаточно для размещения самых крупных частиц, способных пересекать ядерную оболочку. Он содержит структуру, называемую центральным транспортером, посредством которого, как считается, происходит активный транспорт макромолекул.

Рисунок 8.6

Электронная микрофотография комплексов ядерных пор. С этой точки зрения изолированные комплексы ядерных пор, по-видимому, состоят из восьми структурных субъединиц, окружающих центральный канал. (С любезного разрешения доктора Рона Миллигана, Научно-исследовательский институт Скриппса.)

Рисунок 8.7

Модель комплекса ядерных пор. Комплекс состоит из сборки восьми спиц, прикрепленных к кольцам на цитоплазматической и ядерной сторонах ядерной оболочки. Узел «спица-кольцо» окружает центральный канал, содержащий центральный транспортер. (подробнее…)

Селективный транспорт белков в ядро и из него

Основу селективного транспорта через ядерную оболочку лучше всего понять для белков, которые импортируются из цитоплазмы в ядро. Такие белки ответственны за все аспекты структуры и функции генома; они включают гистоны, ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, факторы транскрипции, факторы сплайсинга и многие другие. Эти белки направляются в ядро с помощью специфических аминокислотных последовательностей, называемых сигналами ядерной локализации, которые направляют их транспорт через комплекс ядерных пор.

Первый подробно картированный сигнал ядерной локализации был охарактеризован Аланом Смитом и его коллегами в 1984 году. Эти исследователи изучали Т-антиген обезьяньего вируса 40 (SV40), кодируемый вирусом белок, который инициирует репликацию вирусной ДНК в инфицированных клетках (см. 5). Как и ожидалось для репликативного белка, Т-антиген обычно локализуется в ядре. Сигнал, ответственный за его ядерную локализацию, был впервые идентифицирован путем обнаружения того, что мутация одного остатка лизина предотвращает ядерный импорт, что вместо этого приводит к накоплению Т-антигена в цитоплазме. Последующие исследования определили сигнал ядерной локализации Т-антигена как последовательность из семи аминокислот Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Эта последовательность была не только необходима для транспорта Т-антигена в ядро, но и ее добавления к другим, обычно цитоплазматическим белкам, было достаточно, чтобы управлять их накоплением в ядре.

Сигналы ядерной локализации с тех пор были идентифицированы во многих других белках. Большинство этих последовательностей, как и Т-антиген, представляют собой короткие участки, богатые основными аминокислотными остатками (лизином и аргинином). Однако во многих случаях аминокислоты, формирующие сигнал ядерной локализации, расположены близко друг к другу, но не непосредственно примыкают друг к другу. Например, сигнал ядерной локализации нуклеоплазмина (белка, участвующего в сборке хроматина) состоит из двух частей: пары Lys-Arg, за которой следуют четыре лизина, расположенные на десять аминокислот ниже по течению (10). Обе последовательности Lys-Arg и Lys-Lys-Lys-Lys необходимы для нацеливания на ядро, но десять аминокислот между этими последовательностями могут быть мутированы, не влияя на локализацию в ядре. Поскольку эта последовательность ядерной локализации состоит из двух отдельных элементов, ее называют двудольной. Сходные двудольные мотивы, по-видимому, функционируют как сигналы локализации многих ядерных белков; таким образом, они могут быть более распространены, чем более простой сигнал ядерной локализации Т-антигена. Кроме того, некоторые белки, такие как рибосомные белки, содержат отчетливые сигналы ядерной локализации, которые не связаны с сигналами ядерной локализации, богатыми основными аминокислотами, либо нуклеоплазмина, либо Т-антигена.

Рисунок 8.8

Сигналы ядерной локализации. Сигнал ядерной локализации Т-антигена представляет собой один участок аминокислот. Напротив, сигнал ядерной локализации нуклеоплазмина является двудольным и состоит из последовательности Lys-Arg, за которой следует последовательность Lys-Lys-Lys-Lys (подробнее…)

Импорт белка через комплекс ядерной поры можно оперативно разделить на два этапа, отличающихся тем, требуют ли они энергии (). На первом этапе, который не требует энергии, белки, содержащие сигналы ядерной локализации, связываются с комплексом ядерной поры, но не проходят через пору. На этом начальном этапе сигналы ядерной локализации распознаются цитозольным рецепторным белком, и комплекс рецептор-субстрат связывается с ядерной порой. Рецептор-прототип, названный импортином, состоит из двух субъединиц. Одна субъединица (импортин α) связывается с богатыми основными аминокислотами сигналами ядерной локализации белков, таких как Т-антиген и нуклеоплазмин. Вторая субъединица (импортин β) связывается с цитоплазматическими филаментами комплекса ядерной поры, доставляя целевой белок к ядерной поре. Другие типы сигналов ядерной локализации, такие как сигналы рибосомных белков, распознаются отдельными рецепторами, которые связаны с импортином β и функционируют аналогично импортину β во время транспорта их белков-мишеней в ядро.

Рисунок 8.9

Импорт белка через комплекс ядерных пор. Белки транспортируются через комплекс ядерных пор в два этапа. В показанном примере белок с классической последовательностью ядерной локализации, богатой основными аминокислотами (NLS), распознается импортином (подробнее…)

Второй этап ядерного импорта, транслокация через комплекс ядерных пор, представляет собой энергетическую -зависимый процесс, требующий гидролиза ГТФ. Ключевым игроком в процессе транслокации является небольшой GTP-связывающий белок, называемый Ran, родственный белкам Ras. Конформация и активность Ran регулируются связыванием и гидролизом GTP, подобно Ras или некоторым факторам трансляции, участвующим в синтезе белка (see). Ферменты, которые стимулируют связывание GTP с Ran, локализованы на ядерной стороне ядерной оболочки, тогда как ферменты, которые стимулируют гидролиз GTP, локализованы на цитоплазматической стороне. Следовательно, существует градиент Ran/GTP по всей ядерной оболочке с высокой концентрацией Ran/GTP в ядре и высокой концентрацией Ran/GDP в цитоплазме. Считается, что этот градиент Ran/GTP определяет направленность ядерного транспорта, а гидролиз GTP с помощью Ran, по-видимому, составляет большую часть (если не всю) энергии, необходимой для ядерного импорта. Импортин β образует комплекс с импортином α и ассоциированным с ним белком-мишенью на цитоплазматической стороне комплекса ядерной поры в присутствии высокой концентрации Ran/GDP. Затем этот комплекс транспортируется через ядерную пору в ядро, где присутствует высокая концентрация Ran/GTP. На ядерной стороне поры Ran/GTP связывается с импортином β, вытесняя импортин α и целевой белок. В результате целевой белок высвобождается внутри ядра. Комплекс Ran/GTP-importin β затем экспортируется в цитозоль, где связанный GTP гидролизуется до GDP, высвобождая импортин β для участия в другом цикле ядерного импорта.

Рисунок 8.10

Роль белка Ran в ядерном импорте. Транспорт через комплекс ядерных пор управляется градиентом Ran/GTP с высокой концентрацией Ran/GDP в цитоплазме и высокой концентрацией Ran/GTP в ядре. Комплексы образуются между (подробнее…)

Некоторые белки остаются в ядре после их импорта из цитоплазмы, но многие другие перемещаются туда и обратно между ядром и цитоплазмой. Некоторые из этих белков действуют как переносчики при транспорте других молекул, таких как РНК; другие координируют ядерные и цитоплазматические функции (например, регулируя активность транскрипционных факторов). Белки нацелены на экспорт из ядра с помощью определенных аминокислотных последовательностей, называемых сигналами ядерного экспорта. Подобно сигналам ядерной локализации, сигналы ядерного экспорта распознаются рецепторами внутри ядра, которые направляют транспорт белка через комплекс ядерных пор в цитоплазму. Интересно, что рецепторы ядерного экспорта (называемые экспортинами) связаны с импортином β. Подобно importin β, exportins связываются с Ran, который необходим как для ядерного экспорта, так и для ядерного импорта. Поразительно, однако, что Ran/GTP способствует образованию стабильных комплексов между экспортинами и их белками-мишенями, тогда как он диссоциирует комплексы между импортинами и их мишенями. Этот эффект связывания Ran/GTP с экспортинами определяет перемещение белков, содержащих сигналы ядерного экспорта, из ядра в цитоплазму. Таким образом, экспортины образуют стабильные комплексы со своими белками-мишенями в ассоциации с Ran/GTP внутри ядра. После транспорта на цитозольную сторону ядерной оболочки гидролиз GTP приводит к диссоциации целевого белка, который высвобождается в цитоплазму.

Рисунок 8.11

Ядерный экспорт. В ядре формируются комплексы между белками-мишенями, несущими сигналы ядерного экспорта (NES), экспортинами и Ran/GTP. После транспорта через комплекс ядерных пор Ran GAP стимулирует гидролиз связанного GTP, что приводит к образованию (подробнее…)

Регуляция импорта ядерных белков

Интересным аспектом транспорта белков в ядро является то, что он другой уровень, на котором можно контролировать активность ядерных белков. Факторы транскрипции, например, функциональны только тогда, когда они присутствуют в ядре, поэтому регуляция их импорта в ядро является новым способом контроля экспрессии генов. Как будет показано в главе 13, регулируемый ядерный импорт как факторов транскрипции, так и протеинкиназ играет важную роль в контроле поведения клеток в ответ на изменения в окружающей среде, поскольку он обеспечивает механизм, с помощью которого сигналы, поступающие на клеточную поверхность, могут передаваться в ядро.

В одном механизме регуляции факторы транскрипции (или другие белки) связываются с цитоплазматическими белками, которые маскируют сигналы их ядерной локализации; поскольку их сигналы больше не распознаются, эти белки остаются в цитоплазме. Хорошим примером является фактор транскрипции NF-κB, который активирует транскрипцию легких цепей иммуноглобулина-κ в В-лимфоцитах. В нестимулированных клетках NF-kB обнаруживается в цитоплазме в виде неактивного комплекса с ингибирующим белком (IkB). Связывание с IκB, по-видимому, маскирует сигнал ядерной локализации NF-κB, тем самым предотвращая транспорт NF-κB в ядро. В стимулированных клетках IκB фосфорилируется и расщепляется посредством убиквитин-опосредованного протеолиза, что позволяет NF-κB проникать в ядро и активировать транскрипцию его генов-мишеней.

Рисунок 8.12

Регуляция ядерного импорта транскрипционных факторов. Фактор транскрипции NF-κB сохраняется в цитоплазме в виде неактивного комплекса с IκB, который маскирует его последовательность ядерной локализации (NLS). В ответ на соответствующий внеклеточный (подробнее…)

Импорт других факторов транскрипции в ядро регулируется непосредственно их фосфорилированием, а не ассоциацией с ингибиторными белками. Например, дрожжевой транскрипционный фактор SWI5 импортируется в ядро только на определенной стадии клеточного цикла (см.). В противном случае SWI5 сохраняется в цитоплазме в результате фосфорилирования по остаткам серина, прилегающим к его сигналу ядерной локализации, предотвращая импорт в ядро. Регулируемое дефосфорилирование этих сайтов активирует SWI5 на соответствующей стадии клеточного цикла, обеспечивая его транслокацию в ядро.

Транспорт РНК

В то время как многие белки избирательно транспортируются из цитоплазмы в ядро, большинство РНК экспортируется из ядра в цитоплазму. Поскольку белки синтезируются в цитоплазме, экспорт мРНК, рРНК и тРНК является критическим этапом экспрессии генов в эукариотических клетках. Подобно импорту белков, экспорт РНК через комплексы ядерных пор является активным, энергозависимым процессом, для которого требуется Ran GTP-связывающий белок.

РНК транспортируются через ядерную оболочку в виде РНК-белковых комплексов, которые в некоторых случаях достаточно велики, чтобы их можно было визуализировать с помощью электронной микроскопии (). Субстратами для транспорта являются рибонуклеопротеиновые комплексы, а не голые РНК, и РНК являются мишенями для транспорта из ядра с помощью сигналов ядерного экспорта на связанных с ними белках. Эти белки распознаются экспортинами и транспортируются из ядра в цитоплазму, как описано ранее (см. Ресурсы). Пре-мРНК и мРНК связаны с набором не менее 20 белков (образуя гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов или hnRNP ) на протяжении их процессинга в ядре и возможного транспорта в цитоплазму. По крайней мере, два из этих белков hnRNP содержат сигналы ядерного экспорта и, как полагают, функционируют как переносчики мРНК во время их экспорта в цитоплазму. Как обсуждалось в следующем разделе этой главы, рибосомные РНК собираются с рибосомными белками в ядрышке, а затем интактные рибосомальные субъединицы транспортируются в цитоплазму. Их экспорт из ядра, по-видимому, опосредован сигналами ядерного экспорта, присутствующими на рибосомных белках. Что касается тРНК, то специфические белки, которые опосредуют ядерный экспорт, еще предстоит идентифицировать.

Рисунок 8.13

Транспорт рибонуклеопротеинового комплекса. Клетки слюнных желез насекомых продуцируют крупные рибонуклеопротеиновые комплексы (РНП), которые содержат от 35 до 40 т.п.н. РНК и имеют общую массу около 30 млн дальтон. Эта серия электронных микрофотографий показывает (подробнее…)

В отличие от мРНК, тРНК и рРНК, функционирующих в цитоплазме, мяРНК функционируют в ядре как компоненты механизма процессинга РНК. Возможно, это покажется удивительным, но эти РНК сначала транспортируются из ядра в цитоплазму, где они связываются с белками с образованием функциональных мяРНП, а затем возвращаются в ядро (14). Белки, которые связываются с 5′-кэпами мяРНК, по-видимому, участвуют в экспорте мяРНК в цитоплазму, тогда как последовательности, присутствующие на белках мяРНП, ответственны за транспорт мяРНП из цитоплазмы в ядро.

Рисунок 8.14

Транспорт мяРНК между ядром и цитоплазмой. Малые ядерные РНК первоначально экспортируются из ядра в цитоплазму, где они связываются с белками, образуя мяРНП. Затем собранные мяРНП транспортируются обратно в ядро.